REV-env蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及其免疫原性的评估

发布时间：2020-07-25 12:45

【摘要】：禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一群病理综合征,主要表现为生长迟缓、急性网状细胞肿瘤和淋巴组织慢性肿瘤。REV通常与其他病毒混合感染,并易整合到宿主基因组中,再加上感染后的免疫抑制,导致RE的防控工作越来越困难。本研究旨在通过对env蛋白和gp90蛋白免疫原性的比较,从而筛选出免疫原性更好的蛋白,为RE亚单位疫苗的研究奠定基础。首先,本研究选择毕赤酵母表达系统对REV的囊膜蛋白env进行了表达,构建了含有多个Menv表达盒的重组SMD1168菌株和重组GS115菌株,在摇瓶内利用甲醇进行诱导表达。结果表明,重组env蛋白在构建的重组毕赤酵母菌株中均能成功表达,在GS115菌株中的表达量明显超过在SMD1168菌株中的表达量;重组菌株GS115/pAO815-2Menv的表达量高于GS115/pAO815-4Menv和GS115/pAO815-6Menv的表达量,说明表达盒数量的增加对env蛋白的表达量没有显著的提升作用。通过对诱导条件的优化,重组菌株GS115/pAO815-2Menv在摇瓶内的表达量可达到0.5 g/L。为了获得大量的重组env蛋白和gp90(上清)蛋白,本研究对两种蛋白的发酵培养条件进行了一系列的优化,并对发酵得到的蛋白进行纯化,将纯化前后的蛋白分别置于室温、4℃和-20℃保存以比较其稳定性。结果表明,重组菌株GS115/pAO815-2Menv在29℃、pH=5.5的条件下发酵培养,env蛋白的表达量最高,高达3.5 g/L;重组菌株SMD1168/pPIC9k-gp90在27℃、pH=6.0的条件下发酵培养,gp90(上清)蛋白的表达量最高,高达1.1 g/L;可以通过亲和层析的方法得到纯度较高的重组env蛋白和gp90(菌体)蛋白,gp90(上清)蛋白通过30 kD的超滤管进行浓缩处理;三种蛋白经纯化后稳定性有所提升,但不显著,仍存在严重的降解问题。通过动物攻毒保护实验,对gp90(上清)蛋白、gp90(菌体)蛋白和env蛋白的免疫原性进行了比较。结果表明,三种蛋白均能产生较高水平的ELISA抗体和中和抗体。同时,相对于对照组的病毒载量,gp90(上清)蛋白免疫组的病毒载量降低2.36×10~5倍,gp90(菌体)蛋白免疫组的病毒载量降低6.61×10~3倍,env蛋白免疫组的病毒载量降低6.08×10~3倍。这些结果表明,三种蛋白均具备良好的免疫原性。本研究成功实现了env蛋白在毕赤酵母中的表达,并通过优化发酵培养的条件,可获得大量免疫原性良好的重组蛋白,能有效保护SPF鸡免受REV的感染。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

质粒图谱,摇瓶,体外构建,无义突变

母表达系统对 env 蛋白进行表达，并通过亲和层定点无义突变，突变掉 env 序列中带有的 BglⅡ和载体 pAO815；第二，利用体外构建多表达盒的方达质粒；第三，将构建的重组表达质粒分别电转第四，通过摇瓶诱导表达，比较各重组菌株 env 于后续的发酵培养。结果表明，env 蛋白可以在毕赤达量明显高于 SMD1168 中的表达量，其中，表在摇瓶中的 env 表达量可达 0.5 g/L。0901）重组质粒由本实验室构建保存；大肠杆菌存；毕赤酵母表达载体 pAO815、毕赤酵母菌株 S

体外构建,重组表达质粒,产物

业科学院硕士学位论文第二章禽网状内皮组织增生病病毒 env 蛋白在毕赤酵母中3 重组酵母表达质粒的构建 Menv 的 PCR 产物进行胶回收，用 EcoRⅠ分别酶切该胶收产物和 pAO815 载体，37 对两种酶切产物进行胶回收，并通过 T4 连接酶 16 ℃过夜连接，连接体系（10 μL） Menv 的酶切产物，1 μL 的 pAO815 载体的酶切产物，1 μL 的 10×Buffer，1 μL 的 T到的重组质粒命名为 pAO815-Menv。了体外构建含有多个 Menv 表达盒的重组表达质粒，用 BglⅡ和 BamHⅠ酶切 pAO815整的 Menv 表达盒：5 AOX1-Menv-3 AOX1(TT)；将 Menv 表达盒克隆到经 BamHⅠ5-Menv 中，得到含有两个 Menv 表达盒的重组表达质粒 pAO815-2Menv；用 BglⅡ和 pAO815-2Menv，将两个 Menv 表达盒同时插入经 BamHⅠ线性化的 pAO815-2Menv 中，个 Menv 表达盒的重组表达质粒 pAO815-4Menv；用同样的方法获得含有 6 个 Menv 表达质粒 pAO815-6Menv。将这些重组质粒转化 Top10F 感受态。

条带,感受态,测序,片段

M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：阴性对照M：DL2000 DNA Marker；1：Menv；2：Negative control图 2-3 Menv 基因的扩增Fig.2-3 PCR amplification of Menv鉴定env 转化 Top10F 感受态，小提质粒，以 815Eco，可以获得 1.8 kb 的 Menv 片段（图 2-4）。用 Ec行单酶切，pAO815 酶切后只有一条 7.7kb 的条带 7.7 kb 和 1.8 kb（图 2-5），1.8 kb 的条带为插入的行测序，与预期相符。

【参考文献】