H5N8亚型禽流感病毒PB2蛋白对小鼠高致病性分子标记的鉴定及致病机制研究

发布时间：2020-07-25 20:49

【摘要】：自1996年首次在广东的鹅体内分离鉴定出H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenzavirus,AIV)A/Goose/Guangdong/1/1996(Gs/GD/1996)以来,该亚型病毒一直在我国存在,感染野禽和家禽。H5亚型高致病性AIVs除引起家禽的高发病率和死亡率外,还可以偶尔跨种间传播引起人的高病死率。近年来H5N1病毒与多个不同亚型的神经氨酸酶基因重配为新型H5Nx病毒(包括H5N2、H5N6及H5N8等),其中H5N8亚型AIVs地理分布广泛。因此,了解新出现的H5N8病毒对哺乳动物的致病性并鉴定出高致病性分子标记对该病毒的预测预警具有重要意义。本研究中,我们筛选出2株遗传背景相似但对小鼠致病力存在显著差异的H5N8 AIVs,测定了其生物学特性,并解析了导致2株病毒致病力差异的分子机制及宿主因素。1.对小鼠致病力存在差异的H5N8亚型AIVs的筛选及生物学特性的测定对实验室2012-2014年间分离的不同宿主来源的10株H5N8 AIVs进行小鼠致病力测定,并从中筛选出2株对小鼠致病力有显著差异的病毒A/goose/Easter China/CZ/2013(CZ)和A/duck/EasternChina/JY/2014(JY)作为模式病毒。HA基因遗传进化及基因组差异分析表明2株模式病毒同属2.3.4.4分支,全基因组仅存在25个氨基酸差异。受体结合能力测定表明,2株病毒都具有α-2,3及α-2,6双受体结合特性。体外病毒生长动力学表明,2株病毒在CEF细胞上均能有效复制,滴度可达到约8 log10TCID50/mL;而在MDCK细胞上,CZ病毒可以有效复制,最高滴度约为7 log1oTCID50/mL;JY病毒生长受限,最高滴度小于4 log1C0TCID50/mL。动物试验结果表明,2株病毒虽然对SPF鸡来说都是高致病性的,对小鼠的致病性却不同。CZ对小鼠是高致病性的(MLD50=101.6EID50),JY对小鼠则是低致病性的(MLD50106.5 EID50)。2.PB2蛋白283M和526R协同作用增强H5N8亚型AIVs对小鼠的致病力分别以CZ和JY为骨架构建了一系列单基因替换重组病毒并测定其对小鼠的致病力。结果显示,当CZ病毒骨架中替换入JY病毒PB2、PB1和PA基因后,病毒对小鼠的毒力明显降低;然而,JY骨架中只有替换入CZ病毒PB2基因后(JY-CZPB2),病毒对小鼠的毒力才有所增强。通过对模式病毒PB2基因上差异氨基酸的相互定点突变,我们证明了PB2 283M及526R增强了病毒的聚合酶活性、在哺乳动物细胞(MDCK)上的复制效率以及对小鼠的致病性。进一步试验证实这2个氨基酸在H5N1亚型AIV中也发挥相同的作用。因此,283位甲硫氨酸(M)是H5N8亚型AIVs中一个新的哺乳动物致病力分子标记,且其同526位精氨酸(R)协同作用是导致H5N8病毒对小鼠高毒力的关键因素。3.H5N8病毒PB2蛋白I283M及K526R突变增强病毒对小鼠致病力的宿主因素分析母本病毒r-JY以及突变病毒JYPB2-1283M-K526R感染小鼠3 d后,采集样品利用RNA-seq的方法分析宿主(小鼠肺脏)和病原体的双转录组水平。结果显示,JYPB2-I283M-K526R 感染组中宿主显著性差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)的转录本数目以及表达水平均高于r-JY感染组。GO富集分析表明,r-JY感染组DEGs的功能主要与应激应答、防御应答以及免疫应答相关,而JYPB2-1283M-K526R感染组DEGs的功能主要与应激应答、免疫系统过程以及蛋白结合相关,且突变病毒组免疫相关基因的富集数是母本病毒组的4倍左右。基因表达热图显示,突变病毒感染组的大部分免疫应答相关基因的表达水平显著高于母本病毒感染组,暗示突变病毒可以在小鼠肺脏中诱导过激的天然免疫应答。此外,相比于r-JY以及健康对照组,JYPB2-1283M-K526R可以在感染后3 d诱导小鼠肺脏更强烈的细胞凋亡。病毒转录组序列分析显示突变病毒感染组小鼠肺脏中病毒基因的表达水平显著高于母本病毒感染组,这与突变病毒感染小鼠后其肺脏中检测出更高的病毒滴度相一致。综上所述,PB2蛋白283M及526R的协同作用是增强H5N8病毒对小鼠致病力的分子基础。此外,CZ病毒对小鼠的高致病性与其诱导的异常宿主天然免疫应答相关。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

流感病毒,结构模型

组片段形成ｖＲＮＰ复合体，即病毒各片段一端与异源三聚体ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶（ＲＮＡ逡逑ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ＲＮＡ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ，由ＰＢ２、ＰＢ１和ＰＡ组成）结合，另一端与小环状核蛋逡逑白ＮＰ结合，剩余部分则被反向平行的双螺旋形式的ＮＰ蛋白包裹［１＿３］（图１）。ｖＲＮＰ复合逡逑体是病毒复制和转录的基本功能单位［４＿６］。到目前为止，己经发现的ＩＡＶｓ编码蛋白包括１０逡逑种必需蛋白（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍｌ、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ／ＮＳ２）和邋７邋种非必需逡逑的附件蛋白（ＰＢ１－Ｆ２、Ｎ４０、ＰＡ－Ｘ、ＰＡ－Ｎ１５５、ＰＡ－Ｎ１８２、Ｍ４２邋和邋ＮＳ３）邋［７－１２］。其中血凝素逡逑（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ）是２种主要的糖蛋白，也是病毒的表面抗原。根据Ｈ和Ｎ的逡逑不同，ＩＡＶｓ可分为不同亚型，目前已鉴定出１８种ＨＡ和１１种ＮＡ亚型［１３＿１５］。流感病毒Ｍ逡逑基因主要编码两种蛋白，分别为基质蛋白Ｍｌ和离子通道蛋白Ｍ２。Ｍｌ蛋白的主要功能之逡逑一是参与ｖＲＮＰ复合体输出细胞核的过程［１６］。此外，在流感病毒最后的包装阶段，Ｍｌ蛋逡逑白与ＨＡ、ＮＡ或Ｍ２蛋白的胞质区作用而被带到细胞膜脂阀的包装和出芽位点，并与细胞逡逑膜结合［１６］。在病毒感染早期，Ｍ２蛋白通过调节病毒颗粒中的ｐＨ值，促使ｖＲＮＰ复合体与逡逑

生命周期模式,流感病毒,聚合酶

——顶部细胞质膜［２９＿３１］。最终，成熟的病毒粒子和大量宿主蛋白结合，通过出芽方式释放逡逑（图２）。逡逑ｍＷ逡逑ｒ逦１逦＼逡逑Ｉ逦Ｖｉｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逦＼逡逑ｉｅ—｜逦＼逡逑｜邋题国但逡逑逦逦ＪＩ＾＞ｓｓｓ＝＝！Ｓ！ｓｅ：＆＿ｓ＝＇＝ｃ＇￣Ｃ＝ａ＝＝＝！＝：ｓｓ＊ｉ：％ａ＾＾逡逑（Ｊ逦一逦，邋Ｉｄ逡逑Ｉ逦诚■，＂？、、ｅ｜逦pc嫌ｒａ，逡逑＼逦ＣＲＮ？逡逑图２流感病毒的生命周期模式图（引自Ｖｅｌｔｈｕｉｓ，２０１６）逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｌｉｆｅ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓ逡逑１．３邋ＩＡＶｓ聚合酶的结构和功能逡逑以前，人们对负链ＲＮＡ病毒聚合酶在结构方面的分析非常困难，主要是因为它们分逡逑子量大，在重组系统中表达量少；对于流感病毒来说，聚合酶由多个亚基组成，结构又比逡逑较复杂。近年来，由于冷冻电镜技术及Ｘ射线晶体学技术的突飞猛进，加之大分子蛋白或逡逑复合物表达纯化方法的发展，人们对流感病毒聚合酶的结构有了更深层次的研究。这些新逡逑发现的结构为我们探索由聚合酶参与的分子机制提供了坚实的理论基础［３Ｍ５］。逡逑高分辨率Ｘ射线晶体学结构表明

流感病毒,聚合酶,异源,三聚体

与ＰＡ蛋白Ｃ端相互作用，Ｃ端则与ＰＢ２蛋白Ｎ端相互作用［３４＇３６，３７］。然而，随着结构技术逡逑的发展，研宄人员发现流感病毒聚合酶复合体的３个亚单位是相互缠绕的，因此，其互作逡逑区域可能比之前发现的更为广泛［３Ｍ（）］（图３）。逡逑

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