片形吸虫及其分泌排泄产物对巨噬细胞极化和宿主细胞免疫应答作用的研究

发布时间：2020-07-26 12:41

【摘要】：片形吸虫的两个致病种大片形吸虫和肝片形吸虫均能感染人和哺乳动物引起片形吸虫病,不同宿主的易感性不同,这与片形吸虫对宿主免疫应答的调控或逃避有关。肝片形吸虫及其ESP已被证实能诱导小鼠和牛巨噬细胞的M2型极化,而大片形吸虫在宿主中能否引起相似的免疫反应尚无明确的结论。本研究旨在通过体内外试验探讨大片形吸虫及其ESP在不同宿主引起的巨噬细胞极化和固有免疫反应的差异及其免疫机制,并将淋巴插管模型应用于片形吸虫ESP对宿主免疫细胞的作用研究,以探明片形吸虫及其ESP对宿主免疫应答的调控机制,为理解大片形吸虫与宿主免疫系统的相互作用提供可靠的理论基础。本研究取得以下成果:1.用大片形吸虫囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6),分别于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周处死。通过肝组织切片观察到水牛和小鼠肝脏均能从炎症浸润向结缔组织增生转归,水牛感染14周可见肝内肉芽组织和成虫形成。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞(巨噬细胞)分子标志和细胞因子mRNA表达量,并用ELISA检测血清IFN-γ和IL-4,结果显示:随着感染病程的加剧水牛枯否细胞表型从M2型极化向M1、M2型共上调的趋势转变,KM小鼠枯否细胞表型则由前期的M1+M2混合型向M0型转归,而B6小鼠则表现为更明显的M2型极化。结果表明:大片形吸虫感染水牛和小鼠可诱导肝脏KC表型和细胞因子的表达变化存在较大宿主差异,这些变化的宿主差异是与不同宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力、病变程度以及虫体在宿主体内移行、发育密切相关的。2.用大片形吸虫分泌排泄产物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作为短期试验组,14周每周注射作为长期试验组,注射PBS为对照。通过肝组织切片观察到FgESP腹腔短期注射不会引起小鼠肝脏明显的组织学变化,而长期注射会导致细胞膜通透性增加、结缔组织增生和纤维化趋势。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞(巨噬细胞)分子标志和细胞因子mRNA表达量,结果显示:KM小鼠短期注射FgESP会引起肝组织iNOSmRNA表达下调,但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表达上调,两种小鼠枯否细胞均表现出M2型极化优势;两种小鼠长期注射FgESP则引起完全不同的KCs表型趋势,其中KM小鼠表现为M1和M2型同时上调的混合型,B6则表现为M1和M2均没变化的M0型。3.用200 gg/mL大片形吸虫分泌排泄产物FgESP体外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠来源的传代iPMΦ(野生型)两类MΦ48小时。实时荧光定量PCR测定两类巨噬细胞表面分子标志和细胞因子mRNA表达量,化学法测定细胞Arg-1,Griess法测定细胞上清NO浓度,ELISA测定上清IFN-γ、IL-4浓度,结果显示:水牛BLMΦCD68基因表达下调、Arg-2基因表达上调,Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ浓度下降、IL-4没有明显变化,提示可能存在M2型极化和细胞激活的抑制或凋亡的发生;小鼠野生型iPMΦArg-1合成增加,上清中的IL-4浓度显著升高,而IFN-γ、NO浓度没有变化,也提示M2型极化。结果表明:FgESP体外刺激不同宿主MΦ均能诱导M2型极化。4.用2000μg/mL FgESP分别体外刺激B6小鼠来源的基因敲除iPMΦ(MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-),测定上清NO、IFN-γ、IL-4浓度和细胞裂解物的Arg-1含量,并与野生型iPMΦ进行比较,结果显示:MyD88的缺失导致IL-4的分泌与对照组无差异,而MyD88、TRIF同时缺失导致IL-4的分泌减少,两者均低于野生型iPMΦ;无论是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-还是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP体外刺激诱导的Arg-1产量均与对照组无差异。结果表明:FgESP体外刺激小鼠传代巨噬细胞能诱导依赖于MyD88及其相关通路的M2型激活,促进Th2型细胞因子分泌,促进Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某种方式发挥作用。5.通过外科手术成功构建绵羊的股骨前伪输入淋巴插管、肝脏输入淋,巴插管,成功率分别为约70%和33%左右。6.将200μg荧光标记的肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP于绵羊股骨前区域多点皮下注射(OVA设为对照抗原),并通过股骨前伪输入淋巴插管收集0～7天不同时间点的淋巴液并分离免疫细胞,流式细胞术分析免疫细胞种类和抗原吞噬细胞的比例,荧光实时定量PCR测定巨噬细胞表面分子标志mRNA表达量,ELISA测定淋巴液的IFN-γ和IL-4,结果显示:FhESP注射刺激能使股骨前输入淋巴中的中性粒细胞、单核细胞的比例分别在注射后4～8小时和8～12小时特异性升高,淋巴细胞的比例在注射后4～8小时特异性降低,DCs的比例在注射后4～8小时升高但与OVA对照抗原相比缺乏统计学差异,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞样细胞的比例在各时间点无明显改变;抗原吞噬细胞的数量在注射后4～12h的短暂提高,其中,嗜酸性粒细胞、单核细胞和树突状细胞对FhESP的早期吞噬具有特异性,但DCs的两个亚群的比例变化不具抗原特异性;FhESP刺激能导致淋巴液分离到的细胞M2型分子标志CD206、Arg-2和YM-1的表达均在刺激后24小时内特异性上调,淋巴液IL-4在0～8h特异性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量没有特异性变化。结果表明:绵羊股骨前伪输入淋巴插管操作简单,成功率高,适用于免疫反应动力学试验,通过该模型我们发现FhESP能在绵羊体内促进单核细胞和中性粒细胞的快速招募,提高吞噬细胞抗原吞噬能力,特异性诱导巨噬细胞M2型极化和Th2细胞因子分泌。综上所述,本文认为大片形吸虫感染导致肝脏枯否细胞表型极化趋势和细胞免疫应答趋势存在较大的宿主差异,主要取决于宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力和病变进程。大片形吸虫分泌排泄产物FgESP则能在体、内外诱导动物宿主巨噬细胞依赖于MyD88信号通路的M2型极化,并刺激分泌Th2型细胞因子,通过上调Arg-1抑制NO分泌降低巨噬细胞清除病原的能力,可能是大片形吸虫逃避巨噬细胞免疫杀伤的策略。此外,在绵羊身上成功构建并应用伪输入淋巴插管模型研究肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP对宿主免疫细胞的作用,发现FhESP具有早期招募中性粒细胞和单核细胞、提高吞噬细胞早期抗原吞噬、诱导M2型巨噬细胞和Th2型细胞免疫的能力。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.7
【图文】：

巨噬细胞,诱导物

逦■泄对巨答作用究逡逑的不同（分别为促炎和抗炎）。１＾３１？（＾３１１丨１８９］根据诱导物和功能不同，将Ｍ２ＭＯ进一步逡逑分为ａ、ｂ、ｃ三个亚群（图１－１）。其中，Ｍ２ａ诱导物为ＩＬ－４和ＩＬ１３，表现为抗寄生虫逡逑和组织修复，即典型的Ｍ２Ｍｄ＞；邋Ｍ２ｂ诱导物为ＩＬ－１Ｒ／ＴＬＲ配体和免疫复合物如ＬＰＳ和逡逑１Ｃ，可产生细胞毒分子并保护宿主免受内毒素毒性，也称ｔｙｐｅ邋ＩＩ邋ＭＯ；邋Ｍ２ｃＭ０＞刺激物逡逑为ＴＧＦ－ｐ、ＩＬ－１０和ＧＣ，可能涉及异源Ｍ＜Ｄ失活【９Ｑ】。Ｍ２ａＭＯ、Ｍ２ｃＭ￥均表现为抗炎逡逑效应；Ｍ２ｂＭ０＞则类似Ｍ１Ｍ＜Ｄ，能分泌高水平的促炎症因子，但仍具有Ｍ２Ｍ０＞的表型逡逑特征【８９】，对炎症进行抑制或负调控。有意思的是，组学研宄发现Ｍ１Ｍ０极化会造成转逡逑录组的明显变化，而Ｍ２Ｍ０极化对转录组影响甚微［８９，９１］。有研宄称Ｍ２ＭＯ可能与内毒逡逑素耐受有关［９２】。ＲＭＯ则与Ｍ１ＭＯ、Ｍ２ＭＯ完全不同，ＩＬ４／ＩＬ－１３和ＩＦＮ－ｙ两类通路在逡逑ＲＭＯ激活过程中都起作用

片形吸虫病,全球分布

论文逦对巨答作用？为世界卫生组织ＷＨＯ于２０１３年公布的统计结果，图１－２下为国际健康风险ＢＶＧＨ于２０１５年公布的统计结果），人片形吸虫病的流行范围几乎遍及全带），且呈扩大趋势。流行范围的扩大可能与全球气候变暖、夏季降雨量激１７６］。重度流行区集中在安第斯山脉、加勒比海、北非、西欧以及里海一带；国、日本、菲律宾和韩国为主［ｍ］。除疫源地散发病例，还有一些是通过人口流如２０１５年澳大利亚６名澳洲人从印尼旅行归国后查出片形吸虫感染，推测原过疫源地的生鲜蔬菜［１７７１。现代社会愈发频繁的人口流动（迁居、旅行、务工逡逑造成疫源地的加速扩大的最可能因素之一。逡逑

水牛,肝索,间质

．１宿主感染大片形吸虫后的肝脏组织病理学逡逑（１）水牛感染大片形吸虫的肝脏组织病理学观察逡逑如图２－１－１所示，本地水牛在感染大片形吸虫４邋ｗｐｉ肝组织内即已出现大量的炎症逡逑胞浸润；肝索排列紊乱，汇管区结缔组织增生，肝小叶间质充血；肝细胞呈现肿胀，逡逑的甚至出现了空泡变性。１０邋ｗｐｉ，炎性细胞相对减少，但仍可见间质充血；结缔组织逡逑近大量浸润纤维母细胞，并逐渐生成旋涡状生长的成纤维细胞，启动损伤组织的修复；逡逑现空泡的肝细胞数量下降。１４邋ｗｐｉ，先前损伤的组织局部己经变成结构模糊的肉芽组逡逑，这些组织周围纤维细胞轮廓不清晰；间质充血减轻；肝索排列紧致，肝血窦中的红逡逑胞和ＫＣｓ的数量明显增多。逡逑油镜图（ｌＯＯＯｘ）箭头所示为肝脏中的ＫＣｓ，经Ｈ＆Ｅ染色后细胞核蓝色深染，胞浆逡逑浅蓝紫色，形状多为不规则或椭圆，多充斥于肝索之间的肝血窦中。对比大片形吸虫逡逑入肝脏到定植于胆管的过程中ＫＣｓ的形态变化，可见４邋ｗｐｉ和１０邋ｗｐｉ感染组的ＫＣｓ逡逑为伸出伪足后的梭形或多边形，具有徖移运动的趋势；而１４邋ｗｐｉ感染组的ＫＣｓ则更逡逑向于跟对照组类似的椭圆形或球形，推测可能与更强的分泌功能有关。逡逑

【参考文献】