柔嫩艾美耳球虫CDPK3互作蛋白的筛选及两个蛋白特性的初步研究

发布时间：2020-07-29 19:43

【摘要】：鸡球虫病是由几种艾美耳球虫寄生鸡肠道引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是鸡球虫病的主要致病虫株,本实验室前期研究发现E.tenella钙依赖蛋白激酶3(calcium-dependent protein kinases 3,EtCDPK3)与虫体入侵宿主细胞有关。本研究利用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱分析筛选可能与EtCDPK3互作的蛋白,对筛选出的E.tenella二磷酸核苷激酶(EtNDK)和实验室前期筛选的E.tenella保守蛋白(EtCHP)进行验证。同时对E.tenella锌指蛋白(EtZN1-ZnFP)和保守蛋白(EtCHP)的特性进行分析,并评价了它们的免疫保护效果。1.Co-IP联合质谱筛选柔嫩艾美耳球虫EtCDPK3相互作用蛋白纯化E.tenella子孢子并提取总蛋白,采用Co-IP技术联合质谱进行筛选和定性分析。共筛选出单克隆抗体组145个、单克隆抗体阴性对照组167个、多克隆抗体组227个、多克隆抗体阴性对照组189个潜在蛋白。整理数据获得6个可能与EtCDPK3相互作用的虫体蛋白,包括ATP合成酶γ链、葡萄糖磷酸变位酶1、二磷酸核苷激酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶和2个未知保守蛋白。2.重组质粒的构建及互作蛋白的验证本研究分别构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Et CHP和pET-28a-EtNDK以及真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)-flag-EtCHP和pBiFC-VC155-EtNDK。分别利用His Pull-down和BiFC对EtNDK与EtCDPK3的互作进行了验证。同时,利用GST Pull-down与Co-IP对EtCHP与EtCDPK3的互作进行了验证。结果显示EtNDK与EtCDPK3之间不存在相互作用,EtCHP与EtCDPK3之间也不存在相互作用。3.柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP和锌指蛋白EtZN1-ZnFP功能的初步分析PCR扩增获得EtCHP和EtZN1-ZnFP基因的ORF序列。荧光定量PCR显示EtCHP在子孢子阶段转录水平最高,EtAN1-ZnFP在未孢子化卵囊和子孢子阶段转录水平较高。Western blot检测结果显示二者均有较好地反应原性。间接免疫荧光显示EtCHP主要分布于子孢子和第二代裂殖子表面;EtAN1-ZnFP均匀分布在子孢子和未成熟裂殖体的细胞质中。体外入侵抑制结果显示,anti-rEtCHP的入侵抑制率最高可达28%,anti-rEtAN1-ZnFP的最高入侵抑制率约为30%。4.柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP和锌指蛋白EtZN1-ZnFP的免疫保护实验分别用rEtCHP和rEtZN1-ZnFP免疫雏鸡进行免疫保护实验。结果显示,与未免疫组相比,重组蛋白免疫的鸡病变计分和粪便卵囊产量显著降低。ELISA检测鸡血清中的IgG和细胞因子显示,IgG水平显著高于未免疫攻虫对照组。与未免疫对照组相比,二免7日后血清中除了分化抗原簇8,其他细胞因子变化不明显。但在攻虫后9日,与未免疫攻虫对照组相比,rEtZN1-ZnFP/ISA71(50ug/只)免疫组分化抗原簇4水平显著升高;rEtZN1-ZnFP两个免疫组分化抗原簇8水平都显著升高;rEtCHP两个免疫组IL-17和TGF-β1水平显著高于攻虫未免疫对照组。以上结果表明,rEtCHP和rEtZN1-ZnFP对抵抗E.tenella感染发挥了一定的作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.723
【图文】：

柔嫩艾美耳球虫,子孢子

比样品组与对照组，找出两组之间的差异条带。将剩司进行质谱定性分析，以获得差异蛋白条带的生物信分析ant 软件）原始数据，获得结果。虫子孢子的收集与纯化雏鸡（2 周龄），收集接种后 6-8 d 的粪便，收集卵囊用饱和食盐水漂浮法和次氯酸钠氧化法纯化后得到孢，经胰蛋白酶和鸡胆汁消化、G3 砂芯漏斗过滤后收

子孢子,全蛋白,阴图

图 2.2 子孢子全蛋白的 SDS-PAGEFig.2.2 SDS-PAGE analysis of sporozoite M:蛋白分子质量标准；1：子孢子全Protein molecular weight Marker; 1: Sporoz SDS-PAGE 分析noprecipitation Kit 试剂盒进行 Co-I子孢子总蛋白与树脂一起孵育，洗入 5 μL5×SDS-PAGE 上样缓冲液，体组（Mb）、单克隆抗体阴性对照b-N）。结果显示，分别与各自的阴图 2.3）。

免疫共沉淀,洗脱液,单克隆抗体,蛋白

图 2.3 免疫共沉淀洗脱液 SDS-PAGE 分析ig.2.3 SDS-PAGE analysis of co-immunoprecipitation p；1：单克隆抗体组；2：单克隆抗体阴性对照组；3：性对照组t Marker; 1: Monoclonal antibody group; 2: Monoclonaclonal antibody group; 4: Polyclonal antibody negative 分析获得潜在互作蛋白进行 ESI 质谱鉴定，鉴定结果如表 2.2。共筛Pb-N 组 189 个潜在蛋白。将筛选获得的数的，初步筛选获得 6 个可能与 EtCDPK3 相互合成酶 γ 链（ATP synthase gama chaiparafusin related protein 1，PGM1）、二磷酸核苷葡糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydro

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