酸枣仁汤及JUA对模拟运输应激大鼠心肌细胞凋亡的作用机制

发布时间：2020-07-29 21:34

【摘要】：运输应激严重影响着畜禽的健康,给畜牧业带来极大的损失。本研究运用摇床(60rpm,35℃、2h/d)禁食禁水条件下分别刺激大鼠1天、2天、3天,来模拟夏季运输应激,阐明运输应激大鼠心肌损伤的机制,探讨中药抗运输应激的作用机制,利用应激反应的研究成果来防病治病,尽量减少和避免运输应激对畜牧生产带来的严重危害。通过大鼠临床表现、激素水平、生理生化等指标评价应激模型。利用光学显微镜和电子显微镜观察模拟运输应激大鼠心肌组织显微及超微结构变化,TUNEL染色检测应激大鼠心肌细胞凋亡情况。从基因水平和蛋白水平探讨模拟运输应激导致大鼠心肌细胞凋亡的信号机制,并研究酸枣仁汤对模拟运输应激大鼠心肌损伤的作用机制。体外运用去甲肾上腺素(NE)刺激大鼠心肌细胞(H9C2)建立细胞应激模型,通过对H9C2细胞形态观察,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况等手段来评价细胞应激模型。利用基因芯片(差异基因聚类分析、GO分析、Pathway分析)及microRNA深度测序技术探讨NE诱导H9C2细胞凋亡的潜在机制,筛选关键microRNA和信号蛋白,并从基因水平和蛋白水平研究酸枣仁皂苷A对关键microRNA及主要信号通路的调控作用。主要得出以下结果： 1.摇床(60rpm、35℃、2h/d)在禁食禁水条件下分别刺激大鼠1天、2天、3天,可见大鼠体重下降、体温升高,血糖、血清皮质酮、血浆。肾上腺素和去甲肾上腺素等激素水平均显著升高,不同应激天数大鼠心肌组织HSP27/70/90mRNA水平也都显著升高：应激3天组的CK、LDH、CTnT及BNP也明显升高,说明模拟运输处理导致大鼠发生了明显的应激反应,并且模拟应激3天导致大鼠心肌损伤。 2.本研究发现模拟运输应激通过磷酸化凋亡信号调节激酶1(ASK-1)、p38、c-jun氨基端蛋白激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)和AKT蛋白等激活大鼠心肌组织MAPK和AKT信号通路,然而连续的强烈应激导致促凋亡信号通路(JNK和p38)及抗凋亡信号通路(ERK和AKT)失衡,并进一步激活线粒体凋亡通路,导致大鼠心肌细胞凋亡。 3.酸枣仁汤能够明显降低模拟运输应激大鼠血清中NE、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)及心肌钙蛋白T (CTnT)的含量,降低Bax/Bcl-2比值抑制心肌细胞凋亡,降低心肌损伤。 4.NE通过升高microRNA-325-5p. Bax/Bcl-2比值以及启动JNK、P38信号通路诱导细胞凋亡。JUA可以通过降低Bax/Bcl-2比值,抑制NE诱导的JNK、P38及线粒体凋亡信号通路的激活,促进ERK和AKT信号通路来发挥抗凋亡作用。 结论：本研究60rpm35℃摇床禁食禁水条件模拟夏天公路运输,引起大鼠强烈的应激反应,并通过MAPK信号通路及线粒体通路诱导大鼠心肌细胞凋亡,酸枣仁汤能够降低模拟运输应激导致的大鼠心肌损伤。体外应激激素NE刺激H9C2细胞凋亡验证了体内的应激机制,并且发现-nicroRNA-325-5P能够促进NE诱导的心肌细胞凋亡,JUA可以通过降低Bax/Bcl-2比值,抑制NE诱导的JNK、P38及线粒体凋亡信号通路的激活,促进ERK和AKT信号通路发挥抗凋亡作用。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.3
【图文】：

为了检测模拟运输应激后心肌损伤的程度，我们分别用光学显微镜和电子显微镜对应激前后大鼠心脏结构进行了形态学的观察。如图3-1所示，用HE对大鼠心肌组织染色后，在光学显微镜下观察到对照组大鼠心肌组织肌束排列规则、清晰；而应激1天组（Sid)大鼠的心肌组织有轻微充血和出血，应激2天组（S2d)和3天（S3d)组大鼠心肌组织充血、出血现象更加明显，并伴有细胞核不规则堆积，连续应激过程中突然辞死的大鼠（SD),对其解剖同样进行HE染色观察期心肌组织形态学结构，随处可见逸出的血红蛋白，心肌组织肌束严重地紊乱。如图3-2所示，电子显微镜下观察到对照组和应激1、2、3d组大鼠心肌组织肌小节轮廓明显

Bcl-w基因PCR产物电泳图

试验共挑取5个菌落，进行PCR。PCR反应完毕后取5^11^产物进行1.5%琼脂糖电泳分析，用载体上游和载体下游引物扩增的条带理论大小为900p左右，其实际扩增条带如图6-3:69

【参考文献】

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本文编号：2774525