血清4型和8b型禽Ⅰ群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制

发布时间：2020-07-30 02:34

【摘要】：鸡的心包积液综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)均是由禽Ⅰ群腺病毒引起的急性传染病。近年来,这两种疾病在我国的发病率呈上升趋势,给养鸡业造成很大的经济损失。禽Ⅰ群腺病毒分为A、B、C、D、E等5个基因型,按照血清型分为1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型;基因型和血清型的对应关系为A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。当前我国HHS和IBH的主要病原分别是禽Ⅰ群腺病毒血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)。因此,研制FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗具有重要的应用价值。1 FAdV-8b QD2016株的分离与鉴定本研究从山东某鸡场疑似发生IBH的病例中分离到1株禽腺病毒(命名为QD2016株)。设计了 33对引物,对QD2016株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析。(QD2016株基因组全长为43632bp,与禽Ⅰ群腺病毒E基因型CR119株、YR36株、TR59株、764株、HG株、UPM04217株、HLJ/151129株同属一个大的进化分支,核苷酸序列同源性介于93.4%～98.4%之间;QD2016株与UPM04217株亲缘关系最近,同属于FAdV-8b。2 FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗的研制本研究以FAdV-8b QD2016株和实验室先前分离鉴定的FAdV-4 GX2013株研制二价油乳剂灭活疫苗。根据《中华人民共和国兽药典》的要求建立了两个毒株的种子库,经检验无禽白血病病毒(ALV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)等外源病毒的污染。利用细胞工厂培养LMH细胞,用于扩增FAdV-4 GX2013株和FAdV-8b QD2016株。应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的方法,对扩增的病毒进行定量分析;确定扩增GX2013株和QD2016株的最佳感染复数分别为1.2和3.2,适宜的收毒时间均为接毒后72 h。病毒液经终浓度为1‰的甲醛灭活,以白油为佐剂制成油乳剂灭活疫苗。研制的疫苗为油包水剂型,物理性状稳定,无菌检验合格。取7日龄SPF鸡20只,分为2组,每组10只。第1组为免疫组,于颈部皮下接种制备的灭活疫苗,0.5mL/只;第2组为对照组,于颈部皮下接种等剂量的灭菌白油。接种后21 d内免疫组和对照组的鸡精神状况及采食量均正常,剖检未发现接种部位出现损伤、炎症及疫苗残留等现象,表明该疫苗的安全性良好。将7日龄SPF鸡分成6组,每组10只,分别免疫25 μL、50μL、100μL、250 μL和500μL疫苗,以及500μL灭菌白油(对照组)。免疫后21 d,每组各取5只鸡,分别用FAdV-4GX2013 株(105.5 TCID50/mL)和 FAdV-8bQD2016 株(105.5TCID50/mL)经肌肉注射进行攻毒,0.2 mL/只;分别于攻毒后3 d、5 d、7 d和10 d采集试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。结果显示,攻毒后7 d内咽喉和泄殖腔排毒量相继达到高峰,其中25μL、50 μL和100μL免疫组的排毒量与对照组相比差异不显著(P0.5),250 μL和500 μL免疫组的排毒量与对照组相比差异极显著(P0.01),而这两个免疫组之间的排毒量差异不显著(P0.5)。据此推测:疫苗的免疫剂量为250 μL和500 μL/只均能有效阻止排毒,建议的疫苗免疫剂量为250 μpL/只。取7日龄SPF鸡30只,分为3组,每组10只。第1组和第2组为免疫组,每只鸡颈部皮下接种250 μL疫苗;第3组为对照组,每只鸡颈部皮下接种250 μL灭菌白油。第1组的鸡只于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采血分离血清,分别应用血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGPT)监测抗体消长规律。第2组和第3组的鸡只于免疫后21 d 各取 5 只,分别用 FAdV-4 GX2013 株(106.5 TCID50/mL)和 FAdV-8b QD2016 株(106.5 TCID50/mL)经肌肉注射进行攻毒,0.2mL/只;分别于攻毒后3d、5d、7d和10d采集试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。SNT结果显示,在免疫后7d可检测到FAdV-4和FAdV-8b血清中和抗体,免疫后21 d均达到峰值(210.7和210.6),以后逐渐下降,到免疫后35 d仍能保持较高水平(210.2和29.9);AGPT结果显示,在免疫后14d可检测到FAdV-4和FAdV-8b抗体,21d抗体阳性率最高(100%和90%),随后开始缓慢下降,AGPT抗体增长规律与血清中和抗体保持一致。攻毒保护试验结果显示,对照组的鸡只在攻FAdV-4GX2013株后3d内全部死亡,免疫组的鸡只表现正常,临床保护率达100%;对照组的鸡只在攻FAdV-8bQD2016株后出现采食量下降、精神沉郁、拉稀等现象,免疫组的鸡只表现正常,免疫组和对照组鸡只的咽喉拭子和泄殖腔拭子中病毒含量差异极显著(P0.01)。综上所述,研制的二价油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

逡逑喔＿逡逑图１．１邋ＬＭＨ细胞在不同时间的细胞病变逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＭＨ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅｓ逡逑２．２间接免疫荧光（ＩＦＡ）检测逡逑利用本实验室保存的鸡抗ＦＡｄＶ－８ｂ阳性血清，对ＱＤ２０１６株利用间接免疫荧光进行鉴逡逑定。如图所示，接种ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ细胞可见有明显的绿色荧光（图１．２Ａ），而未接逡逑种ＱＤ２０１６株的ＬＭＨ细胞检测不到荧光（图１．２邋Ｂ）。表明ＱＤ２０１６株属于ＦＡｄＶ－８ｂ且能逡逑在鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）上很好的增殖。逦逡逑图１．２间接免疫荧光检测结果逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋．２邋Ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｉｎｄｉｒｅｃｔ邋ｉｍｍｕｎｏｆ

逑利用设计合成的３３对引物，对ＱＤ２０１６株全基因组进行ＰＣＲ分片段扩增。扩增结果逡逑显示各片段与预期的目的条带大小一致（如图１．３、图１．４）。将各片段分别克隆测序后经拼逡逑接获得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因组序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：贺逡逑ＡＢＢＢ逡逑图１．３ＰＣＲ分段扩增全基因电泳图（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分别为前１７对引物扩增片段逡逑ｉｍ逡逑图１．４邋ＰＣＲ分段扩增全基因电泳图（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分别为后１６对引物扩增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因组序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因组的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ软件包对获得的ＱＤ２０１６株全基因组序列进行系统分析，结果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全长邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量为邋５７．８％。参照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株对其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及编码的蛋白进行了预测（见表１．２）

逑利用设计合成的３３对引物，对ＱＤ２０１６株全基因组进行ＰＣＲ分片段扩增。扩增结果逡逑显示各片段与预期的目的条带大小一致（如图１．３、图１．４）。将各片段分别克隆测序后经拼逡逑接获得了邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株的全基因组序列。逡逑Ｍｌ邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７逡逑｜：‘：贺逡逑ＡＢＢＢ逡逑图１．３ＰＣＲ分段扩增全基因电泳图（１￣１７）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１？１７）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１？１７分别为前１７对引物扩增片段逡逑ｉｍ逡逑图１．４邋ＰＣＲ分段扩增全基因电泳图（１８？３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋（１８－３３）逡逑Ｍ：２００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１８？３３：分别为后１６对引物扩增片段逡逑２．４邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株全基因组序列的分析逡逑２．４．１邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＱＤ２０１６株基因组的分析逡逑用ＤＮＡＳｔａｒ软件包对获得的ＱＤ２０１６株全基因组序列进行系统分析，结果表明：逡逑ＱＤ２０１６邋株全长邋４３６３２邋ｂｐ，Ｇ＋Ｃ邋含量为邋５７．８％。参照邋ＦＡｄＶ－８ｂ邋ＵＰＭ０４２１７邋株对其邋ＯＲＦ邋的位逡逑置以及编码的蛋白进行了预测（见表１．２）

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈海娟;王佳秋;;谈鸡油乳剂灭活疫苗免疫[J];黑龙江畜牧兽医;2010年02期

2 袁本广;杜玉林;;油乳剂灭活疫苗应用时应注意的问题[J];上海畜牧兽医通讯;2009年01期

3 甘军纪;杨军;侯军;顾炳生;刘雷;丛华;吴艳涛;刘秀梵;;油乳剂灭活疫苗规模化生产工艺的设计改进与生产应用[J];中国家禽;2007年08期

4 赵新育;董秀梅;;注射油乳剂灭活疫苗易出现的问题及注意事项[J];畜禽业;2007年10期

5 李国栋;;浅谈鸡油乳剂灭活疫苗免疫[J];中国畜禽种业;2007年11期

6 赵坤;王三虎;李敬玺;姜金庆;赵恒章;李军民;;猪繁殖与呼吸综合征油乳剂灭活疫苗的研制[J];河南农业大学学报;2006年04期

7 石传林;正确使用油乳剂灭活疫苗[J];兽药与饲料添加剂;2001年03期

8 石传林,孙科业;油乳剂灭活疫苗的正确使用[J];农家参谋;2001年03期

9 史同瑞;HPS油乳剂灭活疫苗[J];河南畜牧兽医;2000年05期

10 ;HPS油乳剂灭活疫苗问世[J];江西畜牧兽医杂志;2000年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李香云;张兴晓;杨灵芝;李国良;姚奋卯;;10型鸭疫里默氏杆菌病油乳剂灭活疫苗的研制[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年

2 宁宜宝;蔡祈英;;不同鸡毒支原体株油乳剂灭活疫苗交互免疫作用的测定[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

3 赵振华;李向宇;关平原;日穆德玛;赵心力;顾玉芳;吉仁泰;吴钟灵;成子强;;禽脑脊髓炎油乳剂灭活疫苗效力检验和免疫期试验研究报告[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集[C];2001年

4 姚奋卯;宋宝敏;郝永刚;;用混合机制备油乳剂灭活疫苗体会[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

5 宁宜宝;高和义;蔡祈英;;鸡毒支原体油乳剂灭活疫苗的研制[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

6 罗开健;辛朝安;薜义山;杨克军;黎崇洪;;禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联油乳剂灭活疫苗的研制[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

7 马增军;陈翠珍;沈萍;芮萍;房海;史秋梅;王廷富;李建国;;鸡新城疫-减蛋综合征-传染性法氏囊病三联油乳剂灭活疫苗的研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

8 陈建红;张济培;刘佑明;司兴奎;;水禽禽流感免疫防控关键技术与措施之一——油乳剂灭活疫苗效价快速检测[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2012年

9 张七斤;宋新宇;张和平;孟和毕力格;;乳酸杆菌成分对疫苗免疫增强作用的研究[A];第三届第八次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集[C];2006年

10 邵华斌;杨峻;刘泽文;甘伏生;杨年娣;张玲;;~3禽霍乱、新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究(Ⅰ报)—疫苗的制备、免疫效果及安全性试验[A];实施科技兴农战略促进农村经济发展学术交流论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前6条

1 中国兽药典办公室;鸡传染性支气管炎油乳剂灭活疫苗质量标准[N];中国畜牧水产报;2001年

2 ;鸡油乳剂灭活疫苗的免疫方法[N];中国畜牧兽医报;2008年

3 ;猪细小病毒油乳剂灭活疫苗[N];河南科技报;2004年

4 中国兽药办公室;鸡新城疫油乳剂灭活疫苗质量标准[N];中国畜牧水产报;2001年

5 省畜牧局高级畜牧师 赵国明;猪水肿病多价油乳剂灭活疫苗[N];河南科技报;2004年

6 大名县畜牧水产局 李中习;蛋鸡产前管理八要点[N];河北科技报;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 胡亚歌;血清4型和8b型禽Ⅰ群腺病毒二价油乳剂灭活疫苗的研制[D];扬州大学;2018年

2 戴建华;鸡新城疫—慢性呼吸道病二联油乳剂灭活疫苗的研制[D];扬州大学;2009年

3 聂睿;鸭坦布苏病毒AH-F10株油乳剂灭活疫苗免疫效力评价[D];安徽农业大学;2015年

4 王军亮;鹅副粘病毒的分离鉴定与油乳剂灭活疫苗的研制[D];西北农林科技大学;2003年

5 甘军纪;油乳剂灭活疫苗规模化生产工艺的设计改进与生产应用[D];扬州大学;2006年

6 恩赫曼图胡;鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的研究[D];内蒙古农业大学;2012年

7 周永银;兔产气荚膜梭菌病、大肠杆菌病病原的分离鉴定及其二联油乳剂灭活疫苗的研制[D];南京农业大学;2007年

8 钟辉;奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌油乳剂灭活疫苗的研制及免疫效果评价[D];南京农业大学;2005年

9 董海岚;禽流感油乳剂灭活疫苗实际应用及免疫效果的比较[D];华中农业大学;2008年

10 张美玲;河南省禽规模化养殖场鸡传染性支气管炎分子流行病学调查及其防控[D];河南农业大学;2014年

本文编号：2774880