无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞的机制研究

发布时间：2020-07-30 02:40

【摘要】：乳房炎是奶牛常见病,无乳链球菌(Streptococus agalactiae)是奶牛乳房炎的重要病原体之一。除了在乳腺组织中定植,无乳链球菌还可通过黏附入侵奶牛乳腺上皮细胞(BMECs),宿主则会通过基因表达及程序性死亡来抵御细菌入侵。目前对于无乳链球菌黏附、入侵BMECs及宿主细胞抵御细菌入侵的机制尚不清楚。细胞焦亡(pyroptosis)是裂解性、炎性细胞死亡,主要由胞内菌诱导,是近年发现的生物体对抗病原体感染的新机制。无乳链球菌是否可以诱导奶牛乳腺上皮细胞发生细胞焦亡尚未见报道。本研究通过酶消化法分离原代培养的奶牛乳腺上皮细胞(primary BMECs,pBMECs),并以此细胞为模型,探究无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞的机制以及诱导细胞发生焦亡的情况。首先,本研究利用无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞,通过激光共聚焦与胞内菌落计数的方法来确定细菌入侵细胞;运用比较蛋白质组学分析并筛选出无乳链球菌入侵相关的差异表达蛋白,再进行Western blot验证;采用胞内菌落计数法及qPCR检测细菌特异性基因的方法,分别检测乳腺上皮细胞在LAMB2转录后沉默或LAMB2抗体封闭,整合素(Integrin)抑制剂(RGD)预处理,ITGAV转录后沉默,FAK小分子抑制剂(TAE226)预处理或FAK转录后沉默,Crk转录后沉默或过表达,Vps25转录后沉默或过表达情况下,无乳链球菌入侵到细胞内的细菌数目;采用Western blot检测乳腺上皮细胞在整合素抑制剂(RGD)预处理,FAK小分子抑制剂(TAE226)预处理或FAK转录后沉默,Crk转录后沉默,Vps25转录后沉默情况下,无乳链球菌入侵诱导的FAK表达及其磷酸化水平,Crk表达及其磷酸化水平,Vps25和RhoA表达水平的变化。通过Western blot,ELISA,扫描电镜等方法探究无乳链球菌诱导奶牛乳腺上皮细胞焦亡的情况。实验结果表明:1)无乳链球菌在不同MOI下侵染pBMECs 2 h,可以入侵到细胞内;2)无乳链球菌以MOI为100侵染pBMECs 2 h,收集细胞,提取细胞总蛋白,做蛋白质组检测。通过比较蛋白质组分析,与对照组相比,无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞组共有169个差异表达蛋白,其中37个蛋白可以被GO及KEGG注释,包含16个上调蛋白和21个下调蛋白;3)结合本文研究目的和内容选择Crk、Vps25及RhoA用Western blot进行验证,结果与比较蛋白质组学分析结果一致,无乳链球菌入侵导致Crk表达上调,Vps25及RhoA的表达下调;4)细胞外基质蛋白laminin基因(LAMB2)转录后沉默或抗体封闭LAMB2,会显著抑制无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),预示LAMB2介导细菌入侵;5)特异性抑制剂RGD预处理细胞抑制Integrin活性,或ITGAV转录后沉默减少Integrin表达,显著抑制无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),预示Integrin介导细菌入侵;6)FAK特异性抑制剂TAE226预处理细胞抑制FAK活性,或FAK转录后沉默减少FAK表达,显著减少无乳链球菌入侵到乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),预示FAK介导细菌入侵;7)Crk转录后沉默显著提高无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),反之Crk过表达则显著减少无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),预示Crk具有抵御细菌入侵的作用;8)Vps25转录后沉默显著提高无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.05),反之Vps25过表达则显著减少无乳链球菌入侵到奶牛乳腺上皮细胞的数目(p㩳0.01),预示Vps25具有抵御细菌入侵的作用;9)无乳链球菌入侵促进FAK磷酸化,抑制Crk磷酸化,抑制Vps25和RhoA表达,预示细菌通过激活FAK抑制Crk活性,进而抑制Vps25表达,减弱细胞抵御细菌入侵的能力。同时细菌入侵抑制了RhoA表达,预示可以促进细胞骨架重排,有利于细菌内化;10)Co-IP结果初步证明Crk与Vps25之间存在相互作用,二者可能协同抵御细菌入侵;11)无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞24 h后,Caspas-1被激活,IL-1β及IL-18的分泌增加,细胞膜上形成小孔,表明无乳链球菌通过经典途径诱导奶牛乳腺上皮细胞发生焦亡。总之,无乳链球菌入侵乳腺上皮细胞,通过与细胞外基质laminin(LAMB2)结合实现黏附,通过整合素Integrin实现内化。细菌入侵激活FAK,抑制Crk活性和Vps25表达,同时使得RhoA表达降低,引起细胞骨架重排,细菌进入到细胞内。在此过程中Crk与Vps25起到协同抵抗细菌入侵的作用,FAK的激活则有利于细菌入侵。无乳链球菌入侵诱导奶牛乳腺上皮细胞通过经典途径发生焦亡,以抵抗病原菌感染。实验所得数据为奶牛乳房炎的预防和治疗提供了科学依据和理论基础。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【图文】：

依赖型,分子机制,与非,细胞

无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞的机制研究Caspase-4/5/11介导的非经典途径。在经典途径中，病原体或者其相关毒力因子激活各自的性小体，包括NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2或Pyrin。NLRP3和NLRC4炎症体的激活需激酶NEK7和NAIP3的配合[111-113]。炎症小体传感器触发炎症小体转接器ASC招募Caspase-体，激活Caspase-1，使得Gasdermin D和pro- IL-1β、pro-IL-18被切割，而31kDa的Gasdermi的N端被切割后在细胞膜上打孔形成孔洞，使得胞内的内容物释放，同时也将IL-1β和IL-1放到细胞外[114-121]。对于非经典途径，它是由来自胞内的分离自革兰氏阴性菌的LPS引起的在人的细胞中激活Caspase-4或者Caspase-5，在小鼠细胞中激活Caspase-11。这些被激活Cspase直接裂解Gasdermin D引起细胞焦亡。同时Gasdermin D裂解的N端也可以去激活NL这个炎性小体，进而激活Caspase-1释放IL-1β和IL-18[122-125]。目前这两条途径及其涉及到的性小体和Gasdermin家族是细胞焦亡的研究热点。

技术路线图,技术路线,蛋白质功能,强度值

图2.1 iTRAQ四标实验技术路线g.2.1 iTRAQ four standard experimental technology roS-PAGE电泳检测，FASP酶解，LC-MS质谱分白质鉴定数量；并通过以下步骤：肽段iTR样品间蛋白质的相对含量。和筛选行数据分析，RAW文件通过Proteome Disc 好的数据库，再利用软件 Masc6_20150414.fasta进行查库鉴定。采用Proteom强度值进行定量分析。是选择含量差异2倍以上的作为差异蛋白， Cluster软件对蛋白质功能进行注释，基于

激光扫描共聚焦

内蒙古大学博士学位论文36图2.2 激光扫描共聚焦观察S. agalactiae入侵pBMECs（200×）激光扫描共聚焦显微镜观察S. agalactiae入侵pBMECs 2 h，MOI为100:1和未入侵，Alexa Fluor 594Phalloidin 鬼笔环肽染色肌动蛋白(Actin)呈红色；DAPI染色细胞核呈蓝色；CFDA染色S. agalactiae呈绿色；Marged为叠加后图像。Fig. 2.2 S. agalactiae invaded pBMECs by LSCM（200×）pBMECs were either uninvaded or invaded with S. agalactiae at MOI of 100 for 2 h，Alexa Fluor 594 Phalloidinstaining actin, red; DAPI staining nuclei, blue; CFDA staining S. agalactiae, green; Marged is a superimposedimage.3.2 无乳链球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞的蛋白质组学分析与验证3.2.1 蛋白质组学样品的制备与分析由于比较蛋白质组学检测的要求，为了符合检测的标准，保证数据的全面性与准确性。因此本实验设置两组，正常pBMECs组（control），及S. agalactiae 以MOI为100:1入条件侵pBMECs 2 h，再用含有溶菌酶和抗生素的培养基细胞外杀菌2 h组。为了保证蛋白质组检测要求以及生物学重复要求

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