猪IL-4稳定表达细胞系的建立

发布时间：2020-07-30 03:46

【摘要】：为了构建能稳定表达猪白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)的细胞系,本研究对猪IL-4基因进行了克隆,发现该基因开放阅读框(ORF)长402 bp,编码133个氨基酸,分子质量为15.02 ku,PI为8.64。与牛、绵羊、马、猫、狗和人的同源性分别为80.5%、76.7%、72.7%、72.9%、72.0%和69.2%,而与小鼠的同源性仅为41.5%。通过Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后将p IL-4基因插入含EGFP标签的p IRES2-EGFP载体中,构建出重组质粒p IRES2-EGFP-p IL-4。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,经G418阳性筛选,获得稳定表达猪IL-4的细胞系。p IRES2-EGFP-PIL-4重组质粒转染IPEC-J2细胞后第24小时,荧光定量PCR结果表明,IL-4 m RNA的表达量较对照组及空载体组极显著升高(P0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在连续传代28次以后,仍可见IL-4在基因水平和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体p IRES2-EGFP-p IL-4和能稳定表达猪IL-4的细胞系,为进一步研究其功能奠定了基础。
【图文】：

第7期李俊敏等：猪IL-4稳定表达细胞系的建立图1pIRES2-EGFP-pIL-4重组质粒的鉴定Fig.1IdentificationofrecombinantplasmidpIRES2-EG-FP-pIL-41：重组质粒pIRES2-EGFP-pIL-4；2：质粒pIRES2-EGFP-pIL-4的EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切产物；M：DNA分子质量标准1：RecombinantplasmidpIRES2-EGFP-pIL-4；2：ProductsfrompIRES2-EGFP-pIL-4digestedbyEcoRⅠandBamHⅠ；M：DL5000DNAMark-erExTaq酶25L，ddH2O21L。PCR扩增条件：预变性94℃5min；变性94℃1min，退火温度54℃30s，延伸72℃1min（34个循环）；延伸72℃5min；4℃保存。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，GelDNAExtractionKit回收目的片段（具体操作参考说明书），经EcoRⅠ＋BamHⅠ双酶切后，插入到载体pIRES2-EGFP中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素（100g/L）的LB琼脂平板，37℃过夜培养。培养14h后，挑选白色单菌落接种于10LLB液体培养基中，取1L菌液进行PCR鉴定。阳性菌液接种于含有氨苄青霉素的10mLLB液体培养基中，37℃，160r/min振荡培养14h。快速质粒小提试剂盒抽提质粒，送上海英潍捷基贸易有限公司测序。利用NCBI在线ORFFinder软件查找猪IL-4基因的开放阅读框，利用DNAstar软件翻译ORF核苷酸序列，用DNAman软件中的多序列比对程序与GenBank上已发表的牛、绵羊、马、猫、狗、人和小鼠IL-4的氨基酸序列进行同源性比较；通过ExpAsy的Prot-scale程序计算疏水性。1.5细胞培养用含10％胎牛血清（Gibco）的高糖DMEMF12（Gibco）将IPEC-J2细胞（ATCC）培养于37℃、5％CO2的细胞培养箱中。细胞传代时先用PBS清洗2～3次，再用0.25％的胰酶（Gibco）进行消化。1.6转染及筛选按照脂质体Lip3000（Invitrogen）的说明书，将重组质粒转入处于对数生长?

中国兽医科学第47卷图3阳性细胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白对照；B：转染pIRES2-EGFP-pIL-4重组质粒的细胞后第1天的荧光表达情况A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater图4转染后细胞的生长曲线Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差异极显著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows图2猪IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下划线部分为开放阅读框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物种的IL-4氨基酸序列同源性比较Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies达（见图3）。且转染IL-4基因后，细胞的生长状态与对照组相比并未见明显变化（见图4）。说明该基因能在IPEC-J2中成功表达，且对细胞的生长没有显著影响。2.5阳性细胞筛选及鉴定用浓度为1mg/mL的G418结合有限稀释法对转染细胞进行连续筛选，每48h传代一次，传代20次和28次时分别在倒置荧光显微镜下观察，均可见物种Species猪Pig黄牛Cattle绵羊Sheep马Horse猫Cat犬Dog人Human小鼠Mice猪Pig100黄牛Cattle80.5100绵羊Sheep76.790.4100马Horse72.767.463.6100猫Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

中国兽医科学第47卷图3阳性细胞集落400×Fig.3ThepositivecellscolonyA：空白对照；B：转染pIRES2-EGFP-pIL-4重组质粒的细胞后第1天的荧光表达情况A：Blankcontrol；BIPEJ-C2cellstranfectedbypIRES2-EGFP-pIL-4after1dlater图4转染后细胞的生长曲线Fig.4Thegrowthcurveoftransfectedcells**表示差异极显著（P＜0.01）。下同**thedifferencearehighlysignificant（P＜0.01）.Thesameasfollows图2猪IL-4基因序列Fig.2SequencesofporcineIL-4gene下划线部分为开放阅读框TheunderlinesequenceshowedtheopenreadingframeofIL-4表2不同物种的IL-4氨基酸序列同源性比较Table2HomologycomparisonofIL-4aminoacidsequencesindifferentspecies达（见图3）。且转染IL-4基因后，细胞的生长状态与对照组相比并未见明显变化（见图4）。说明该基因能在IPEC-J2中成功表达，且对细胞的生长没有显著影响。2.5阳性细胞筛选及鉴定用浓度为1mg/mL的G418结合有限稀释法对转染细胞进行连续筛选，每48h传代一次，传代20次和28次时分别在倒置荧光显微镜下观察，均可见物种Species猪Pig黄牛Cattle绵羊Sheep马Horse猫Cat犬Dog人Human小鼠Mice猪Pig100黄牛Cattle80.5100绵羊Sheep76.790.4100马Horse72.767.463.6100猫Cat72.966.965.462.9100犬Dog72.065.963.661.182.6100人Human69.264.764.761.557.956.1100小鼠Mice41.541.538.541.741.541.940.7100％900

【参考文献】

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【共引文献】

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