ICSI和SCNT猪早期胚胎发育过程中转录组比较分析
发布时间：2020-07-30 10:22
【摘要】：哺乳动物早期胚胎发育起始于受精卵的形成,经数次卵裂形成具有植入能力的囊胚,这一过程所涉及到的细胞分裂模式在不同物种间具有高度保守性,但各物种在该过程中转录组的调控规律却有很大差别。目前,关于早期胚胎发育的研究主要聚焦在人和小鼠上,而在猪上却十分欠缺。猪不仅是必不可少的经济动物,也是应用前景广阔的医疗模型。为了解析由卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)得到的猪早期胚胎发育过程中转录组的变化规律、挖掘调控该过程的关键基因、评估猪和其他物种间早期胚胎发育过程的保守性并探寻体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)效率偏低的分子机制,本研究基于单细胞测序技术,对分别利用SCNT技术和ICSI技术得到的两组猪植入前各时期胚胎的转录组进行系统分析。本研究以ICSI组胚胎为对照组,研究猪早期胚胎发育过程中转录组的变化规律,并和其他物种进行保守性分析,最后挖掘潜在导致SCNT技术效率低下的关键基因。主要结果如下:(1)在ICSI组胚胎发育过程中,合子基因组激活(zygote genome activation,ZGA)事件是一个连续过程,在由合子发育成囊胚的各个过程中均存在,其最大变化发生在由4细胞向8细胞发育的时期,在该时期激活的基因主要在转录起始、转录因子活性调节及mRNA加工等方面发挥作用。(2)在ICSI组相邻时期间共鉴定得到9931个差异表达的蛋白编码基因(differentially expressed gene,DEG),表明在胚胎早期发育过程中转录组发生了很大变化。聚类分析结果表明绝大多数DEGs均具有十分明显的时期特异性表达模式。其中,在8细胞期开始上调表达的基因多在转录起始和调控方面发挥作用,而在囊胚期特异表达的基因则主要在物质和能量代谢方面发挥作用。(3)在ICSI组和SCNT组胚胎发育的各个时期,鉴定出数量差别很大的可变剪切基因,发现在各个时期均表达的可变剪切基因主要发挥一些基础的功能,如RNA剪切和细胞周期等。分析还发现绝大多数可变剪切基因主要通过1到2个主效转录本来发挥作用。对ICSI组主要ZGA时期组间特异表达的转录本进行分析,发现这些转录本对应的基因大多富集到与RNA形成相关的生物学过程。(4)鉴定得到88711个多聚腺苷酸化位点(polyadenylation site,PAS),各时期样品中PAS数量差别极大。分析发现基因内PAS数量和其表达量及可变剪切数量均呈弱相关。对ICSI组主要ZGA时期组间具有不同利用率PAS的基因进行功能富集,结果发现这些基因在mRNA产生和加工等方面发挥作用。(5)鉴定得到66619个高置信度的基因间长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA),其中18612个lincRNAs是新鉴定得到的。在ICSI组和SCNT组中均鉴定得到大量相邻时期间差异表达的lincRNA,且这些lincRNA具有明显的时期特异性表达模式。功能预测结果表明不同时期特异表达的lincRNA通常具有不同的生物学功能。核心lincRNA分析结果表明red模块(4细胞期)中的核心lincRNAs主要在转录起始方面发挥功能,而salmon模块(囊胚期)中的核心lincRNAs则主要在物质代谢方面发挥作用。(6)母系基因在不同物种早期胚胎发育过程中的保守性要强于合子基因。猪和人之间保守的母系基因数量多于小鼠和人,同时少于猴和人之间保守的母系基因。猪和人之间保守的合子基因数量最多,显著多于小鼠和人以及猴和人之间保守的合子基因。此外,猪和人早期胚胎发育各个时期内基因的表达情况较为相似,而猴和小鼠与猪之间的基因表达相似性则处于较低水平。(7)SCNT组胚胎发育过程中,转录组的最大变化发生在由桑椹胚向囊胚发育的阶段,晚于ICSI组胚胎。SCNT组4细胞期和8细胞期胚胎表达的转录本数量、可变剪切基因数量及基因总数均低于ICSI组相应时期。在SCNT组和ICSI组相同时期间共鉴定得到6080个DEGs,其中在8细胞期DEGs数量最多,囊胚期次之,这些DEGs主要在RNA加工运输、脂质代谢和信号转导等方面发挥作用。(8)SCNT组合子期至4细胞期胚胎的转录组和ICSI组相应时期胚胎转录组相似性较高,而在8细胞期和桑椹胚期的转录组则和ICSI组的合子期至4细胞期的转录组较为相似。在SCNT组囊胚期,28.6%的特异表达的基因在ICSI组合子期至桑椹胚期已经上调表达。对375个胚胎发育相关的核心基因进行分析,结果表明41.9%的基因在SCNT组和ICSI组同一时期胚胎之间差异表达。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828
【图文】：
图 1-1 猪早期胚胎发育模式图源于网络：https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToFig. 1-1 Schematic graph of pig early embryo developmentThe graph was downloaded from Internet(https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToxNDA=).胚胎发育相关的研究进展胚胎发育是一个十分复杂的连续性生理过程，其中涉及大子物质，而这些物质又需要庞大的调控网络来协调彼此之的正常发育。目前，关于猪早期胚胎发育的研究相较于小是广度上均远远落后。由于物种的特殊性，与猪早期胚胎因或培养环境对卵母细胞体外成熟率、体外囊胚发育率和影响等方面，另外有部分研究是关于特定基因在胚胎发育些年高通量测序技术的发展和实验技术的进步，使得越来
图 1-2 SCNT 技术流程图Fig. 1-2 Workflow for SCNTNT 技术以一种全新的生殖方式，不经过精卵融合而产生出基因型与亲代，在动物育种、医学研究和生物工程等研究领域带来了巨大的变革面，研究人员结合基因编辑技术可以获得具有改良性状的新品种。2017 Burkard C 团队通过基因编辑敲除猪合子中编码猪繁殖与呼吸障碍的 CD163 基因的第 7 外显子，最终生产出对该疾病免疫的新品种，产业成本 Burkard et al. 2017 。在医学研究方面，研究人员可以人类疾病模型，便于后续研究。目前，用于研究亚急性坏死性脑病的失模型猪 Quadalti et al. 2018 和用于研究侏儒综合征的生长激素）修饰模型猪 Yu et al. 2018a 均已成功建立。在生物工程领域，克物反应器，批量化地生产医用蛋白。2015 年，张普民教授和魏泓教基因组编辑工具将人血白蛋白 cDNA 敲入猪基因组，获得了重组人
Fig. 1-3 Genomic location and context of lncRNAs表 1-1 LncRNA 分类 St Laurent et al. 2015Table 1-1 Different classes of lncRNAs分类标准 类别长度 Large intervening noncoding RNAVery long intergenic noncoding RMacroRNA功能的 DNA 元件之间的联系 Enhancer-associated RNAPromoter-associated long RNAUpstream antisense RNAPromoter uPstream TranscriptTelomeric repeat-containing RNA功能 miRNAprimary transcriptspiRNA primary transcripts
本文编号：2775408
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828
【图文】：
图 1-1 猪早期胚胎发育模式图源于网络：https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToFig. 1-1 Schematic graph of pig early embryo developmentThe graph was downloaded from Internet(https://www.qunfengshe.com/articles/QXJ0aWNsZToxNDA=).胚胎发育相关的研究进展胚胎发育是一个十分复杂的连续性生理过程，其中涉及大子物质，而这些物质又需要庞大的调控网络来协调彼此之的正常发育。目前，关于猪早期胚胎发育的研究相较于小是广度上均远远落后。由于物种的特殊性，与猪早期胚胎因或培养环境对卵母细胞体外成熟率、体外囊胚发育率和影响等方面，另外有部分研究是关于特定基因在胚胎发育些年高通量测序技术的发展和实验技术的进步，使得越来
图 1-2 SCNT 技术流程图Fig. 1-2 Workflow for SCNTNT 技术以一种全新的生殖方式，不经过精卵融合而产生出基因型与亲代，在动物育种、医学研究和生物工程等研究领域带来了巨大的变革面，研究人员结合基因编辑技术可以获得具有改良性状的新品种。2017 Burkard C 团队通过基因编辑敲除猪合子中编码猪繁殖与呼吸障碍的 CD163 基因的第 7 外显子，最终生产出对该疾病免疫的新品种，产业成本 Burkard et al. 2017 。在医学研究方面，研究人员可以人类疾病模型，便于后续研究。目前，用于研究亚急性坏死性脑病的失模型猪 Quadalti et al. 2018 和用于研究侏儒综合征的生长激素）修饰模型猪 Yu et al. 2018a 均已成功建立。在生物工程领域，克物反应器，批量化地生产医用蛋白。2015 年，张普民教授和魏泓教基因组编辑工具将人血白蛋白 cDNA 敲入猪基因组，获得了重组人
Fig. 1-3 Genomic location and context of lncRNAs表 1-1 LncRNA 分类 St Laurent et al. 2015Table 1-1 Different classes of lncRNAs分类标准 类别长度 Large intervening noncoding RNAVery long intergenic noncoding RMacroRNA功能的 DNA 元件之间的联系 Enhancer-associated RNAPromoter-associated long RNAUpstream antisense RNAPromoter uPstream TranscriptTelomeric repeat-containing RNA功能 miRNAprimary transcriptspiRNA primary transcripts
【参考文献】
相关博士学位论文 前3条
1 张志人;猪体细胞核移植早期胚胎的合子基因激活及表观遗传修饰的研究[D];吉林大学;2018年
2 张恒;L1-siRNAs在猪早期胚胎中的功能研究及猪早期胚胎单细胞转录组分析[D];东北农业大学;2018年
3 刘玉胜;母源BTG4在小鼠早期胚胎发育中的功能和机制研究[D];中国科学技术大学;2017年
本文编号：2775408
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