猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12与宿主细胞互作蛋白的筛选及鉴定
发布时间：2020-07-30 11:23
【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍、哺乳仔猪的呼吸道疾病和高死亡率为特征的一种病毒性传染病。PRRSV感染引起机体的免疫抑制,从而形成持续感染。研究表明,PRRSV的许多非结构蛋白在拮抗宿细胞先天性免疫与调控病毒复制方面起着重要作用,为了探究PRRSVNSP12的功能,本研究从蛋白相互作用的角度探究NSP12在病毒感染中的作用,本试验以HP-PRRSVHuN4毒株NSP12为研究对象,构建PGBKT7-NSP12诱饵质粒,通过酵母双杂交系统筛选与NSP12相互作用的宿主细胞蛋白,并且对筛选结果进行验证与分析。为了建立NSP12的研究基础,首先利用原核表达系统成功表达NSP12,得到特异性较好的NSP12的鼠源多克隆抗体;经Western-blot和间接免疫荧光鉴定,证明本研究所制备的多克隆抗体能够特异性识别PRRSV病毒NSP12及真核表达的NSP12蛋白,为后续试验提供辅助材料。随后,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-NSP12,验证无毒性与自激活现象后,通过酵母双杂交系统筛选PAMcDNA文库中与NSP12相互作用的宿主细胞蛋白;经筛选与回复杂交试验验证,结果显示:共筛选到8种能够与NSP12相互作用的宿主细胞蛋白,根据BLAST序列比对与GO分析,筛选到的蛋白主要为一些伴侣蛋白如FTH1、ZNF598和介导细胞凋亡过程的相关蛋白 LGALS3、UCP2 等。为了对酵母双杂交系统筛选到的阳性结果进行验证,本试验研究进一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦等试验验验证了 CD63、LGALS3两种蛋白与NSP12的相互作用。结果表明:NSP12能将LGALS3沉淀下来,且明显的共定位于胞浆;NSP12与CD63蛋白也有共定位现象,说明NSP12与这两种蛋白的确存在相互作用。单独体外过表达LGALS3后感染PRRSVHuN4病毒,不同时间收取细胞上清,测定病毒TCID50,与对照组相比结果表明:LGALS3对PRRSV增殖有抑制作用。上述研究结果为深入解析PRRSV病毒感染机制提供了新的理论依据。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
【图文】：
殖与呼吸综合征病毒ＮＳＰ１２与宿主细胞相互作用蛋白的筛选期也随之变短；病毒的热稳定性差，在低温条件下活２０ｍｉｎＤ８］，４５ｍｉｎ则会完全失去致病性。病毒对Ｐ洗漆剂中不Ｂ纟稳定生存。逡逑染的主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞（ＰＡＭ），完全分化染的最初细胞目标。另外也有报道发现树突状细染试验表明，ＰＲＲＳＶ也可在传代非洲绿猴肾细胞（显的细胞病变（0＞＾（职如０邋６￡『６（＾，匚？￡），可见细胞聚ＰＲＲＳＶ在ＰＡＭ细胞上生长较好，在其它种类细胞在以上细胞均能够良好增殖。逡逑
图２尼多病毒目分类逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑
图２尼多病毒目分类逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑１．３．２邋ＰＲＲＳＶ基因结构与其编码的结构蛋白逡逑ＰＲＲＳＶ基因组全长约１５ｋｂ，在５’端有帽子结构，３’端含有ｐｏｌｙ（Ａ）序列，ＰＲＲＳＶ逡逑的基因组ＲＮＡ是正链、３’端聚腺苷酸化的分子。在５’端和３’端分别含有一段非编逡逑码区（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＵＴＲ邋），含有至少邋１０邋个开放阅读框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ逡逑ｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦ），包括邋ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦｓ３－７、ＯＲＦ５ａＢ３－２６】。其中，逡逑病毒的复制酶基因包括大开放性阅读框ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ，位于基因组５’端，约占逡逑基因组全长的四分之三（图２）。比起保守性更高的ＯＲＦｌｂ，邋ＯＲＦｌａ的大小常常不逡逑同，因为该基因的非结构蛋白２邋（ｎｓｐ２）具有很高的变异性。ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ编码逡逑两个非常大的非结构聚合蛋白，多聚蛋ｔｌｐｐｌａ、ｐｐｌａｂ；而这些多聚蛋白可进一步逡逑水解切割形成成邋ＮＳＰｌｃｔ，ＮＳＰ１（３，邋ＮＳＰ２－ＮＳＰ６，ＮＳＰ７ａ，ＮＳＰ７ｐ，邋ＮＳＰ８－ＮＳＰ１２邋等逡逑—系列非结构蛋０（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｎｓｐ）［２７－３＇］（图邋３）。逡逑Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍｅｎｏｍｉｃ邋ＲＮＡ逦Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｓｕｂｅｎｏｍｉｃ邋ｍＲＮｓ逡逑
本文编号：2775472
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
【图文】：
殖与呼吸综合征病毒ＮＳＰ１２与宿主细胞相互作用蛋白的筛选期也随之变短；病毒的热稳定性差，在低温条件下活２０ｍｉｎＤ８］，４５ｍｉｎ则会完全失去致病性。病毒对Ｐ洗漆剂中不Ｂ纟稳定生存。逡逑染的主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞（ＰＡＭ），完全分化染的最初细胞目标。另外也有报道发现树突状细染试验表明，ＰＲＲＳＶ也可在传代非洲绿猴肾细胞（显的细胞病变（0＞＾（职如０邋６￡『６（＾，匚？￡），可见细胞聚ＰＲＲＳＶ在ＰＡＭ细胞上生长较好，在其它种类细胞在以上细胞均能够良好增殖。逡逑
图２尼多病毒目分类逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑
图２尼多病毒目分类逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｏｆ邋Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ邋ｏｒｄｅｒ逡逑１．３．２邋ＰＲＲＳＶ基因结构与其编码的结构蛋白逡逑ＰＲＲＳＶ基因组全长约１５ｋｂ，在５’端有帽子结构，３’端含有ｐｏｌｙ（Ａ）序列，ＰＲＲＳＶ逡逑的基因组ＲＮＡ是正链、３’端聚腺苷酸化的分子。在５’端和３’端分别含有一段非编逡逑码区（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ邋ｒｅｇｉｏｎ，邋ＵＴＲ邋），含有至少邋１０邋个开放阅读框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ逡逑ｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦ），包括邋ＯＲＦｌａ、ＯＲＦｌｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦｓ３－７、ＯＲＦ５ａＢ３－２６】。其中，逡逑病毒的复制酶基因包括大开放性阅读框ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ，位于基因组５’端，约占逡逑基因组全长的四分之三（图２）。比起保守性更高的ＯＲＦｌｂ，邋ＯＲＦｌａ的大小常常不逡逑同，因为该基因的非结构蛋白２邋（ｎｓｐ２）具有很高的变异性。ＯＲＦｌａ和ＯＲＦｌｂ编码逡逑两个非常大的非结构聚合蛋白，多聚蛋ｔｌｐｐｌａ、ｐｐｌａｂ；而这些多聚蛋白可进一步逡逑水解切割形成成邋ＮＳＰｌｃｔ，ＮＳＰ１（３，邋ＮＳＰ２－ＮＳＰ６，ＮＳＰ７ａ，ＮＳＰ７ｐ，邋ＮＳＰ８－ＮＳＰ１２邋等逡逑—系列非结构蛋０（Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｎｓｐ）［２７－３＇］（图邋３）。逡逑Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍｅｎｏｍｉｃ邋ＲＮＡ逦Ｅｘｒｅｓｓｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｓｕｂｅｎｏｍｉｃ邋ｍＲＮｓ逡逑
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 杨汉春,黄芳芳,郭鑫,高云,李华,陈声;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ-4株全基因组序列测定与分析[J];农业生物技术学报;2001年03期
2 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力;猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定[J];中国兽医学报;1998年02期
3 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
相关硕士学位论文 前1条
1 王鑫;猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对Ⅰ型干扰素表达影响的分析[D];中国农业科学院;2016年
本文编号：2775472
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