乳酸菌的分离鉴定及拮抗牛呼吸系统疾病主要病原菌的初步研究

发布时间：2020-07-30 17:04

【摘要】：近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)给我国的肉牛养殖业造成了较严重的经济损失,导致诱发BRD的主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)由于其耐药性不断增强,给该病的预防和控制造成了严重的困扰。因此寻找新型治疗方法,优化治疗策略已迫在眉睫。本研究通过传统分离法对采自延吉、吉林等地的酸奶、泡菜样品中的乳酸菌进行分离鉴定,并以Pm、Mh、M.bovis为指示菌,初步筛选具有拮抗作用的乳酸菌。本实验从样品中共分离得到115株乳酸菌,并以致病菌Pm、Mh、M.bovis为指示菌进行初筛后得到5株具有较好抑菌效果的乳酸菌,分别编号为P5(鼠李糖乳杆菌,Lactobacillus rhamnosus)、P1(植物乳杆菌,Lactobacillus plantarum)、24-1(嗜酸乳杆菌,Lactobacillus acidophilus)、8-1(屎肠球菌,Enterococcus faecium)、Z1(鼠李糖乳杆菌,Lactobacillus rhamnosus)。本研究还对5株乳酸菌的生理特性、溶血活性和耐药性等进行了检测。并对其发酵上清液进行抑菌活性的研究。试验结果表明,复筛出菌株P5抑菌活性最强,生长速度较快,对绝大多数抗生素敏感,无溶血活性,热稳定性好。选取P5株评价其对小鼠BRD肺炎模型的保护作用。结果表明,P5对由Pm和Mh诱发的BRD肺炎小鼠起到明显的预防保护作用。研究结果为BRD新型预防策略的制定提供了理论指导和实验依据。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【图文】：

图 1.1 乳酸菌 16S rDNA 电泳图M:DL2000 DNAMarker；1-12 菌株编号：8-1、P1、24-1、P5、Z1、37-3、38-5、41-2、Z2、16-2、9-1、13-1Fig.1.1 electrophoresis of lactobacillus 16S rDNAM: DL2000 DNAMarker;Strains 1-12 were numbered : 8-1， P1， 24-1， P5， Z1、37-3， 38-5， 41-2， Z2， 16-2， 9-1， 13-1表 1-6 序列同源性比对结果Tab.1-6 homology alignment results of sequences菌株编号 鉴定结果 同源性 菌株编号 鉴定结果 同源性9-1 L. plantarum 99% P6 L. plantarum 99%19-3 L. plantarum 98% 8-3 L. plantarum 99%6-1 L. plantarum 99% P2 L. plantarum 99%31-3 L. plantarum 99% P3 L. plantarum 99%30-2 L. plantarum 99% P4 L. plantarum 99%7-1 L. plantarum 99% E1 L. plantarum 99%

1.3.2 具有拮抗作用乳酸菌的筛选采用牛津杯法和牛支原体颜色变化单位来测定乳酸菌上清液对 BRD 主要病原菌的生长抑制作用，从 115 株乳酸菌中筛选出 12 株具有拮抗 BRD 主要病原菌功能的乳酸菌如表 1-7 和 1-8。菌株种类为两株植物乳杆菌 P1、41-2，一株短乳杆菌 16-2，一株嗜酸乳杆菌 24-1，三株鼠李糖乳杆菌 P5、Z2、Z1，一株干酪乳杆菌 9-1，一株清酒乳杆菌 38-5，两株屎肠球菌 41-2、8-1，一株嗜热链球菌 13-1。其中 P1、P5、24-1、8-1、Z1 抑菌效果较好，菌株抑菌圈效果如图 1.2 所示。因此选择这五株菌进行后续研究。

组为只加 200μl 蒸馏水的空白组，方法按照 1.2.3.3 操作。上清液与病原菌共培养生长的测定后的 Pm 和 Mh 接种于液体 BHI，调菌浓度为 106CFU/mL 并加入 10%上清液，37℃培养。在培养后的 0h，24h，48h 分别取样，梯度稀释后，37℃培养 24h 后进行菌落计数。M.bovis 接种于液体 PPLO，调浓L，并加入 10%培养 48h 的乳酸菌上清液，37℃培养，在培养后的 0h，2样测菌液浓度。生理特性的研究生长曲线的测定乳酸菌生长曲线如图 2.1。它们在培养 12h 左右进入对数生长期，P5 和入稳定期，24-1 在培养 30h 后进入稳定期，Z1 和 8-1 在培养 35h 后进 P1 生长速度比其他三株快，但是稳定期最大菌体数量同 8-1、Z1 相比较

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