丁酸梭菌龙眼发酵液对溃疡性结肠炎干预作用的研究

发布时间：2020-07-30 20:48

【摘要】：本研究探讨丁酸梭菌液体发酵龙眼多糖的最佳发酵工艺以提高丁酸梭菌的活菌量及发酵液中总多糖的含量,并通过UC小鼠模型来检验发酵液对溃疡性结肠炎的药物干预作用。第一部分探究了丁酸梭菌与龙眼多糖发酵的协同效应。先用酶提法提取干龙眼肉的龙眼多糖,然后将龙眼多糖提取液与丁酸梭菌混合发酵,通过单因素试验分别评价了龙眼多糖添加量、接种量、发酵时间、初始pH对丁酸梭菌生长的影响,再根据单因素试验的结果设计L9(3~4)正交试验以进一步优化发酵工艺参数。结果表明,丁酸梭菌液体发酵龙眼多糖的最佳发酵工艺参数为:龙眼多糖含量为20%,接种量为3%,发酵时间为16h,初始pH为7.0。四个因素对发酵过程的影响顺序为:发酵时间初始pH龙眼多糖添加量接种量。验证试验结果表明,发酵液中丁酸梭菌的活菌量能保持在1.3×10~7cfu/mL以上,且多糖含量与发酵前相比平均提高了464.65mg/mL。第二部分研究发酵液对溃疡性结肠炎的药物干预作用。先将丁酸梭菌与龙眼多糖在最佳发酵工艺下发酵获得龙眼多糖发酵液,然后将发酵液应用于UC小鼠模型中,研究龙眼多糖发酵液对小鼠体重、结肠长度、DAL评分、临床评分、结肠组织,血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量、结肠肠道菌群的影响。实验结果显示,模型组小鼠体重下降至18.31g,结肠长度缩短至7.17cm,DAL评分为3.56,临床评分为5.33,组织学损伤评分为11.33,而发酵液组小鼠体重仅下降至21.80g,结肠长度仅缩短至9.33cm,DAL评分为1.22,临床评分为1.67,组织学损伤评分为4.67,且各项指标均显著低于模型组。ELISA检测小鼠血清结果显示,模型组IL-6、IL-10和TNF-α的含量分别为34.63 pg/mL、29.71 pg/m L和37.62 pg/mL,而发酵液组小鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的含量分别为25.80pg/mL、34.68 pg/mL和31.27pg/m L,与模型组相比均具有显著性差异。高通量测序结果显示发酵液显著抑制了小鼠结肠中致病菌属螺杆菌属的相对丰度。本研究得出的结论为丁酸梭菌与龙眼多糖发酵具有协同效应,即龙眼多糖能促进丁酸梭菌的生长,丁酸梭菌发酵龙眼多糖后可以增加发酵液中的多糖含量。同时龙眼多糖发酵液对DSS诱导的UC小鼠具有一定的保护作用,其作用机制一方面可能与其增强抑炎因子并抑制促炎因子产生的抗炎效果有关,另一方面可能与其通过抑制致病菌属螺杆菌属的相对丰度来维持肠道菌群的平衡有关。
【学位授予单位】：仲恺农业工程学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S816
【图文】：

标准曲线,苯酚-硫酸法,标准曲线

研究采用多糖分析中常用的苯酚-硫酸法(Albalasmeh et al., 201的含量。标准曲线制作确称量干燥的葡萄糖100mg，用去离子水溶解并定容于100mL容g/mL 葡萄糖标准液。用移液枪分别精确地吸取 0，100，200，300μL 的 1mg/mL 葡萄糖标准液于 10mL 容量瓶中定容，摇匀，度（0，10，20，30，40，50，60μg/mL）的葡萄糖标准溶液。同浓度的标准溶液 2.0 mL 于 10 mL 的试管中，用移液枪依次加入好的 6%苯酚溶液，摇匀，再用移液管依次加入 5.0 mL 浓硫酸匀后放入沸水浴中加热 25min，再放入冷水浴中，直至冷却至室光光度计在 490 nm 处测定待测样品的吸光度(姜琼等, 2013)。以μg/mL）为横坐标、以每个浓度相对应下的吸光度（A）为纵坐合后得到线性回归方程，即标准曲线，如图 2.2 所示。

菌落形态,丁酸梭菌,菌落形态,龙眼

图 2.3 丁酸梭菌菌落形态.3 不同龙眼多糖添加量对丁酸梭菌生长的影响不同龙眼多糖添加量对丁酸梭菌生长的影响不同，本试验中，在温度 37 量 3 %，初始 pH 为 7.0 条件下，研究了不同龙眼多糖添加量（5 %，10%，30 %，40 %）对丁酸梭菌生长的影响。在发酵 14h 后，采用稀释涂布数法测定丁酸梭菌活菌量。结果如图 2.4 所示，随着龙眼多糖添加量的丁酸梭菌的活菌量也越来越多。当龙眼多糖添加量为 30 % 时，丁酸梭菌量最多，达到 1.16×109cfu/mL，且与其他组相比差异极显著（p<0.01在龙眼多糖添加量为 30 % 时丁酸梭菌生长的效果最好。而当龙眼多糖低于 10 % 时，丁酸梭菌活菌量比对照组（龙眼多糖添加量为 0）要低，添加龙眼多糖会对原先丁酸梭菌培养基的环境造成干扰，而当龙眼多糖达到一定比例后才具有促进丁酸梭菌生长的效果。因此，在后续的试验眼多糖添加量暂定为 30 % ，在后面的试验中继续优化。

字母,丁酸梭菌,字母表示,龙眼

图 2.4 龙眼多糖添加量对丁酸梭菌生长的影响.（x±SE，n=3）图中字母相邻表示差异显著（p<0.05）, 字母相间表示差异极显著（p<0.05）, 没有字母表示差异不显著, 下图同

【参考文献】