抗牛病毒性腹泻病毒有效藏草药的筛选与评价研究

发布时间：2020-07-31 13:29

【摘要】：牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea,BVD)又称牛病毒性腹泻-黏膜病,主要是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引发的急性、接触性传染病。据流行病学调查,近几年来国内外的BVDV感染趋势不断扩大,给养牛业的经济发展造成了严重损失。该病原BVDV具有高度的变异性,可导致疫苗保护失效和持续性感染,在防治方面带来了很大的困难。体外研究高效敏感的抗BVDV药物对牛病毒性腹泻病的治疗及防控具有一定的指导意义。本研究主要对矮紫堇、诃子等16种藏药进行了体外抗BVDV药效学试验,初步筛选出具有抗BVDV的藏药,并深入探究了有效藏药的抗病毒作用。具体取得了如下研究结果:1.利用水提法提取16种藏药,并采用CCK8检测和CPE观察相结合的方法测定16种藏药的最大安全浓度。结果表明,测得BVDV的TCID_(50)为10~(-4.67)/0.1m L;16种藏药的最大药物安全浓度范围在0.5mg/mL~16 mg/mL之间。2.通过CCK8检测和CPE观察相结合的方法初步筛选具有抗BVDV的有效藏药。结果表明:16种藏药中诃子、矮紫堇和甘青乌头对BVDV均有一定的抑制作用,且最大抑制率均大于50%。其中,矮紫堇的抗病毒效果要好于诃子和甘青乌头,并优于利巴韦林。3.采取先加药后加病毒、先加病毒后加药及药和病毒预先作用的3种不同加药方式推测3种藏药的抗病毒作用方式。结果表明:3种藏药对BVDV均有一定的直接杀灭作用,且均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。其中,矮紫堇直接杀灭效果最佳且优于利巴韦林,当其浓度为1mg/mL时,抑制率可达72.86%,培养上清液中病毒含量最低,滴度为10~(-2.80)/0.1mL,对BVDV有极显著的直接灭活作用(P0.01)。4.采用荧光定量PCR和ELISA检测方法探究3种藏药对7种抗病毒相关因子表达水平的影响。RT-PCR结果表明:诃子、矮紫堇、甘青乌头作用于BVDV感染的细胞后,均能上调MX-1、PKR、IRF-1、IRF-7、INF-α免疫因子的转录,而不上调IRF-3和IFN-β的转录。ELISA试验结果表明,3种藏药均能显著上调IFN-α的蛋白表达量(P0.05),而对于IFN-β无明显的调节作用。综上所述,16种藏药初步筛选出诃子、矮紫堇和甘青乌头对BVDV有一定的抑制作用,推测这3种藏药的抗病毒主要效应可能是通过药物直接灭活游离的BVDV而发挥作用,其中矮紫堇直接灭活病毒作用最显著,且抑制效果要优于利巴韦林。此外,3种藏药在抗病毒免疫因子方面均具有一定的调节作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.7
【图文】：

水提法,藏药,冻干粉,中药

图 2-1 水提法提取的藏药Fig.2-1 Tibetan medicine extracted by water extraction表 2-1 中药冻干粉得率Table2-1 The yield of Chinese medicine freeze-dried powder

显微镜,显微镜下,细胞形态

图 2-2 MDBK 显微镜形态学观察Fig.2-2 The microscopic observation of cells morphologyA.100 倍显微镜下的细胞形态；B.200 倍显微镜下的细胞形态 MDBK 的 CPE 观察

紫堇,毒性作用,藏药

图 2-3 部分藏药致 MDBK 病变观察Fig.2-3 The observation of cytopathogenicity caused by partial Tibetan drugsA.16mg/mL 矮紫堇对 MDBK 毒性作用(200×)；B.4mg/mL 矮紫堇对 MDBK 毒性作用(200×)；C. 1mg/mL 矮紫堇对MDBK 毒性作用(200×)；D.正常细胞（200×) ；E.64mg/mL 甘青乌头对 MDBK 毒性作用(200×)；F.16mg/mL 甘青乌头对 MDBK 毒性作用(200×)；G.8mg/mL 甘青乌头对 MDBK 毒性作用(200×)；H.256ug/mL 利巴韦林 MDBK 毒

【参考文献】