羊无浆体持续感染过程中外膜蛋白MSP1a末端重复和MSP2高变区的变异特征研究

发布时间：2020-07-31 16:38

【摘要】：羊无浆体(Anaplasma ovis)感染绵羊、山羊和一些野生反刍动物,引起无浆体病。主要表面蛋白(Major Surface Proteins,MSPs)是其外膜蛋白,也是重要抗原。为分析其持续感染过程中,外膜蛋白的抗原变异特征,本研究进行了:1.羊无浆体持续感染绵羊模型的构建。静脉注射羊无浆体阳性菌血(海北株),人工感染三只健康绵羊(编106~#、134~#、174~#)。接种后一年内,定期采血,经涂片镜检、PCR检测(靶标msp4基因,869bp目的片段)和间接ELISA检测,成功构建了羊无浆体持续感染绵羊模型。2.羊无浆体MSP1a蛋白的抗原变异分析。用artemis软件对本实验室测序的羊无浆体海北株全基因组进行序列分析,发现其msp1a基因存在末端重复。据其序列设计引物AoMsp1a(F3/R3),以不同时间点全血DNA为模板(模型羊持续感染1年内,用间接ELISA检测抗体水平,选择在抗体曲线拐点处的基因组样品),扩增得到10个msp1a末端重复序列,长度883bp,克隆至pGEM-T easy载体,转化E.coli(DH5α),涂布培养、挑单菌落扩大培养后提取质粒测序。将10个msp1a序列翻译后进行氨基酸序列比对分析。所有msp1a基因序列同源性99%,末端重复氨基酸序列总长度为197氨基酸,其结构分为4个区段:3个完全一致的重复区段(55个氨基酸)和1个32氨基酸区段,且与原始感染菌株的蛋白序列一致。结论:在实验性持续感染模型绵羊中,羊无浆体MSP1a蛋白序列和结构保持稳定。3.羊无浆体MSP2蛋白高变区(Hypervariable region,HVR)抗原变异分析。对本实验室测序的羊无浆体海北株全基因组数据进行比对分析,发现msp2基因家族包含1条全长表达序列及5条同源基因,所有同源基因均包含HVR序列。针对msp2表达序列HVR设计套式PCR引物lzn111(F/R)和lzn22(F/R),扩增10个不同时间点样品的msp2高变区,最终获得长度457bp的目的片段,克隆至pGEM-T easy质粒,转化E.coli(JM109),涂布培养挑取单菌落扩大培养后提取质粒测序。每个时间点样品测序得到10-15条序列,共得到130条HVR序列。翻译为氨基酸序列进行比对分析发现,MSP2高变区包含2个高变微区,由3个保守序列隔开。高变微区在持续感染过程中,通过msp2表达位点与同源假基因高变区编码序列之间的基因重组产生抗原变异,并且序列多样性不断增加。结论:MSP2蛋白高变区编码序列在羊无浆体持续感染过程发生持续序列变异。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855
【图文】：

018 届硕士学位论文 羊无浆体持续感染绵羊模型的构建15图2.1 红细胞内的羊无浆体Fig.2.1 A. ovis in red blood cells2.2 试验绵羊羊无浆体 PCR 检测结果图2.2 羊无浆体PCR检测电泳结果图Fig.2.2 PCR detection of A. ovisM：DNA分子质量标准； 106,134,174:MSP4扩增产物M：2000DLMarker； 106,134,174:PCR product of MSP4每次采血提取的各实验羊基因组样品均进行PCR检测，阳性样品PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果约为869bp（图2.2）。2.3 试验绵羊持续感染过程的抗体动态曲线对3只试验绵羊持续感染过程采集的所有血清样品进行间接ELISA试验的结果表明，感染后特异性抗体一般在6至13天之内出现，3周之后抗体会达到一个高峰，随后开始出现一定的动态波动（图2.3）。对感染后的一年内所采样品进行抗体动态分析，得到不同试验羊持续感染过程的抗体动态曲线[68]。

Fig.2.1 A. ovis in red blood cells2.2 试验绵羊羊无浆体 PCR 检测结果图2.2 羊无浆体PCR检测电泳结果图Fig.2.2 PCR detection of A. ovisM：DNA分子质量标准； 106,134,174:MSP4扩增产物M：2000DLMarker； 106,134,174:PCR product of MSP4每次采血提取的各实验羊基因组样品均进行PCR检测，阳性样品PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果约为869bp（图2.2）。2.3 试验绵羊持续感染过程的抗体动态曲线对3只试验绵羊持续感染过程采集的所有血清样品进行间接ELISA试验的结果表明，感染后特异性抗体一般在6至13天之内出现，3周之后抗体会达到一个高峰，随后开始出现一定的动态波动（图2.3）。对感染后的一年内所采样品进行抗体动态分析，得到不同试验羊持续感染过程的抗体动态曲线[68]。

018 届硕士学位论文 羊无浆体持续感染绵羊模型的构建16图2.3 实验绵羊抗体动态曲线（106#、134#、174#）Fig. 2.3 Kinetics of anti-A. ovis antibody in 3 experimentally infected sheep (Nos 106,134,174)3 讨论本实验旨在构建羊无浆体持续感染动物模型，为进一步研究其持续感染过程中的抗原变异做物质准备与初步探索。通过对实验羊感染过程中的血涂片镜检发现，通常在两周左右，羊红细胞中无浆体的感染率上升到一定程度，才能在血涂片中发现感染于红细胞内的羊无浆体病原。在一个月后，血涂片镜检便很难再观察到红细胞内的无浆体病原。PCR检测方法敏感性更高，感染一周左右即可检测到。并且在随后的持续采集样品中，PCR检测结果均表现为阳性。这与无浆体感染宿主后的病原学特征表现一致[78]。同时我们还使用了实验室建立的AAAP蛋白间接ELISA检测方法对持续采集的所有样品进行了检测，结果表明，在人工感染5至15天内就可以观察到抗体浓度的变化，各感?

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本文编号：2776730