金黄色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮细胞对乳脂合成的影响

发布时间：2020-07-31 18:06

【摘要】：乳脂是牛乳中重要的营养物质之一,也是乳品质和饲养效率的重要衡量指标,探索奶牛乳脂合成规律及其调控机制为国际反刍动物营养学科所关注。奶牛乳腺炎是一种奶牛乳腺组织的炎症变化,伴有乳汁生理和化学的变化。乳腺炎是奶牛养殖业中发病率最高、流行最快、造成损失最为严重的疾病之一,病原微生物是引起奶牛乳腺炎的主要因素之一,金黄色葡萄球菌是最为常见的接触性乳腺炎病原菌,具有入侵乳腺上皮细胞的能力。目前对金黄色葡萄球菌入侵奶牛乳腺上皮细胞对乳脂合成的影响及其调控机制尚不清楚。本文通过原代培养,分离并纯化奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,利用高清晰度激光共聚焦显微镜观察金黄色葡萄球菌入侵引起的细胞骨架重排,菌落计数法测定侵入细胞内的细菌数量,ELISA检测细胞培养液中甘油三酯(TAG)、软脂酸(PA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量变化,质谱测定细胞内37种脂肪酸的累积;同时,采用Western Blot检测细胞内mTORC1信号通路活性、乳脂合成相关转录因子和关键酶的表达变化,免疫共沉淀和酵母双杂交发现和验证与乳脂合成相关的蛋白分子之间的相互作用关系,为阐明金黄色葡萄球菌入侵引起的乳脂合成紊乱的分子机制提供依据。实验结果表明:1)金黄色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮细胞2 h激光共聚焦显微镜下观察可见细胞骨架排列发生变化;2)随着入侵时间的延长,细胞内细菌的数量增加;3)光学显微镜下观察,随着入侵时间的延长,细胞形态改变并伴随细胞数量减少;4)金黄色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮细胞4h~16 h,细胞培养液中TAG、PA和DHA含量显著降低(p0.05),细胞内mTORC1信号通路活性、转录因子PPARγ和SREBP1表达以及关键酶Lipin1、ACC和FAS表达呈现先上升后降低的趋势;5)细菌入侵细胞8 h细胞内脂肪酸总量、饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸含量均显著降低(p0.05),细菌入侵影响了细胞内脂肪酸的合成;6)通过质谱检测、免疫共沉淀和酵母双杂交验证,证明Lipin1与PPARγ具有直接相互作用关系,且二者之间有372种共同的结合蛋白,生物信息学预测其中108种蛋白构成相互作用网络;7)通过对质谱检测出的327种共同结合蛋白的人工筛选,注意到Q95KV1是IKKα的内源性抑制剂,进而通过Western Blot在以anti-Lipin1和anti-PPARγ为诱饵抗体的免疫共沉淀复合物中检测到了IKKβ和IκBα,由此使得乳脂合成相关的Lipin1和PPARγ与炎症相关的功能蛋白IKKβ和IκBα联系起来。总之,通过本文实验我们证明金黄色葡萄球菌入侵牛乳腺上皮细胞会导致细胞骨架重排,细胞变形和裂解,影响乳脂合成;随着细菌入侵时间的延长,对细胞内mTORC1信号通路活性和乳脂合成相关转录因子及关键酶的表达影响呈现先升高后降低的趋势;Lipin1与PPARγ具有直接的相互作用关系并且与炎症相关的功能蛋白相关联,为下一步研究脂质代谢与炎症反应关系提供了依据。论文通过构建乳房炎细胞模型,确定金黄色葡萄球菌入侵对乳脂合成的影响并初步探讨了可能的分子机制,将对阐明奶牛乳房炎发病机制,提高乳品质量,提高奶业的核心竞争力具有重要意义。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23
【图文】：

乳脂,合成基因

内蒙古大学硕士学位毕业论文9图1.1 乳脂合成基因网络(Bionaz and Loor, 2008)Fig 1.1 Networks among genes involved in milk fat synthesis5.4 脂肪酸合成相关酶脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)一种多功能复合酶，广泛参与脂肪酸合成的各阶段，是脂肪酸合成过程中的限速酶，无明显的组织特异性，广泛分布动物体内脂肪和肝脏等组织中，可催化乙酰辅酶A从头合成长链硬脂酸。是饱和与不饱和脂肪酸的合成的底物基础。动物体内脂肪酸合成酶的活性与多种指标相关，包括体内脂肪酸的合成和体脂的沉积，另外其还广泛参与胞内信号转导[95]、膜结构[96]、蛋白质的乙酰化过程[97]。FAS是脂质代谢基因中唯一一个具有适应性进化特征的基因[98]。乙酰辅酶 A 羧化酶(Acetyl-CoAcarboxylases，ACCs)与FAS都是动物体内脂肪酸合成的限速酶，ACC是分子间羧化转移家族成员之一

乳腺组织,分离法,乳腺上皮细胞

因此需要培养并分离得到较纯的乳腺上皮细胞作为之后的研究材料。根据细胞对于胰酶的敏感度不同从而对于原代培养出的混合细胞进行差异消化、分离纯化，经过多次消化传代，得到较纯的乳腺上皮细胞系(图2.1)。3.2 金黄色葡萄球菌入侵 BMECs 导致细胞骨架重排细菌入侵宿主细胞时能够引起细胞骨架重排，本实验用金黄色葡萄球菌入侵BMECs细胞，共聚焦显微镜下观察细胞骨架的重排。实验设置2组，对照组（Control）与细菌入侵组。图2.1 从乳腺组织中分离得到的牛乳腺上皮细胞Fig.2.1 Bovine mammary epithelial cells (BMECs) obtained from mammary gland separationA: 组织块分离法分离出奶牛乳腺上皮细胞12天；B：组织块分离法分离出奶牛乳腺上皮细胞14天（黑色部分为组织块）；C：组织块分离法分离出奶牛成纤维细胞16天（黑色部分为组织块）；D：消化传代得到较纯奶牛乳腺上皮细胞。结果代表四次独立性实验(n=4)A: The tissue separation method separated the BMECs for 12 days (the black part is the block); B: Thetissue separation method separated the BMECs for 14 days (the black part is the block); C: The tissueseparation method separated the BMECs for 16 days (the black part is the block); D: Using differentialtrypsinization obtaine

细胞骨架,共聚焦显微镜,鬼笔环肽,荧光素

其中细菌入侵组使用的入侵比为MOI=30:1，入侵时间为2 h，用荧光素探针标记鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，用DAPI对细胞核染色，用醋酸羟基荧光素（CFDA）对金黄色葡萄球菌进行染色，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照，结果如图2.2，2.3所示。对照组中，BMECs细胞骨架整齐排列，而细菌入侵组BMECs细胞中细胞骨架发生解聚，细胞骨架重排的细胞数居多。因此金黄色葡萄球菌入侵BMECs会导致细胞骨架重排。图2.2 共聚焦显微镜观察牛乳腺上皮细胞细胞骨架（400×）Fig 2.2 The cytoskeleton in BMECs by confocal (400×)Alexa Fluor 594 Phalloidin鬼笔环肽染色肌动蛋白(A、D、G)，DAPI染色细胞核(B、E、H)，叠加图(C、F、G)。结果代表三次独立性实验(n=3)。Actin was stained with Alexa Fluor 594 Phalloidin(A、D、G), nucleus was stained with DAPI(B、E、H)

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