我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立

发布时间：2020-07-31 19:44

【摘要】：近年来,禽类星状病毒对家禽业的影响受到了世界范围内的广泛关注。其中鸡星状病毒(Chicken astrovirus,CAstV)可单独引起雏鸡肾炎、腹泻性肠炎及发育缓慢等症状,是导致雏鸡腹泻、痛风等疾病的重要病原体之一。目前我国鸡星状病毒病分子流行病学调查的结果还未见公开报道,为了解CAstV在我国鸡群中的流行情况,本研究开展了我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查工作,建立了检测鸡星状病毒的绝对荧光定量方法,同时还分离了一株鸡星状病毒,为进一步研究鸡星状病毒生物学功能提供了技术手段和生物材料。1.我国部分地区鸡星状病毒病流行病学调查本研究自2017～2018年,从江苏省、安徽省、山东省和广东省的7个地区采集了 195份样品,进行PCR检测鸡星状病毒的感染情况。实验结果表明,41份成年鸡样本中仅1份阳性样本,阳性率为2.44%,而154份1日龄雏鸡样本的阳性率高达82.47%(127/154),综合阳性率为65.64%。测序结果分析比对显示,阳性样品包含7个毒株,全部属于鸡星状病毒。遗传分析结果表明,我国鸡群中同时存在I型和II型鸡星状病毒。从检测结果来看,与以往国外报道相似,低日龄雏鸡更容易检测到病毒,而成年鸡检测率较低。2.鸡II型星状病毒绝对定量qRT-PCR检测方法的建立到目前为止,尚无针对CAstV定量检测方法的相关研究。本研究通过鸡星状病毒RNA酶依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因的研究,成功的建立针对II型鸡星状病毒绝对定量qRT-PCR的方法。设计了针对CAstV-RdRp基因特异性的引物并成功制备了阳性质粒标准品,利用该方法检测病毒在LMH细胞中增殖情况。结果表明,CAstV感染LMH细胞早期虽无明显病变,但病毒可以在LMH细胞中生长繁殖。本研究建立的检测CAstV-RdRp基因绝对定量PCR方法为研究病毒致病性以及生物学功能提供了一种检测技术手段。3.鸡星状病毒分离鉴定及全基因组测序分析为了进一步对国内流行CAstV进行更深入的研究,本研究使用鸡肝癌细胞系(LMH)对CAstV病毒进行了分离和鉴定。结果显示,病毒可以在LMH细胞中增殖,并盲传4代后可产生细胞病变。利用LMH细胞分离到了一株CAstV,命名为CAstVNJ1701株,属于II型鸡星状病毒。随后对其近全长基因组进行PCR扩增和测序,结果得到基因组长度为7492核苷酸,其结构特点与已发表的鸡星状病毒基因组结构特点相似,包括ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框。将三个开放阅读框进行遗传进化分析,结果显示本研究分离的CAstV NJ1701株与CAstV FP3株的同源性较高,通过ORF2衣壳蛋白分类,可划分为CAstV B1群;CAstV NJ1701株ORF1a和ORF1b基因序列与其他CAstV的ORF1a和ORF1b序列同源性较低,处于一个相对独立的分支。4.病毒接种鸡胚致病性实验将分离的病毒通过卵黄囊接种6日龄鸡胚,盲传4代后发现鸡胚有明显致弱和致死现象,qRT-PCR检测也证实病毒可以在鸡胚中增殖。病毒接种鸡胚孵化率实验结果表明,30枚病毒接种鸡胚,仅11鸡胚孵化成功,孵化率为36.67%。死亡的鸡胚生长发育出现明显问题,呈现侏儒胚现象,说明鸡星状病毒感染可以导致鸡群孵化率降低。通过研究内容二所建立的方法,检测了 RdRp基因在雏鸡20个组织中的表达情况。结果表明,CAstV病毒基因雏鸡盲肠中表达量最高,其次是肾脏,而在心脏中表达量最低,这一结果为将来临床检测样品的采集提供依据。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65;S858.31
【图文】：

星状病毒,系统发育树

逡逑的发明和检测方法的优化，星状病毒的易感动物范围可能会进一步扩大（见图２）邋［２］。逡逑Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ逡逑ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｌ邋｜邋＾逡逑Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ逦Ｓ邋身署办逡逑９ｅｎ0９ｒｏｕｐＨ邋＼邋妒逡逑Ｂａｔ＾！Ｙ逦／邋ｙ邋ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ邋ＩＩ逡逑＞逦ＨＡｓｔＶ－ＭＩＢｌ逡逑－逡逑Ｍａｍａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ逡逑ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ邋Ｉ逡逑图２星状病毒系统发育树逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋Ａｓｔｒｏ邋ｖｉｒｕｓ逡逑研宄人员根据感染宿主范围将星状病毒科划分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒逡逑属［２５］，国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）又根据不同病毒衣壳蛋白之间的差异又分为１９种哺逡逑乳动物星状病毒和３种禽星状病毒。其中禽星状病毒属根据遗传距离分为：Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ逡逑Ｉ邋．Ａ型，仅包含火鸡星状病毒１型（ＴＡｓｔＶ－１）邋：邋Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋Ｇ邋Ｉ邋．Ｂ型，包括禽肾炎病毒逡逑１邋型（ＡＮＶ－１）、禽肾炎病毒邋２邋型（ＡＮＶ－２）和鸡星状病毒（ＣＡｓｔＶ）邋；Ａｖａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ邋ＧＩＩ．Ａ逡逑型，包含火鸡星状病毒２型（ＴＡｓｔＶ－２）和鸭星状病毒（ＤＡｓｔＶ）邋［２６］。禽星状病毒与哺乳动逡逑物星状病毒基因差异巨大，在最保守的ＲｄＲｐ区域，禽星状病毒与人星状病毒１型（ＨＡｓｔＶ－１）逡逑仅有４０％左右的同源性［２７］。逡逑

基因组结构

２．１．２鸡星状病毒基因组结构及分类逡逑ＣＡｓｔＶ全长为７．５ｋｂ左右，ＯＲＦｌａ开放阅读框与ＯＲＦｌｂ开放阅读框有部分重合区域，逡逑ＯＲＦｌｂ开放阅读框与ＯＲＦ２开放阅读框之间存在几十个碱基的空隙（图３）。ＣＡｓｔＶ的逡逑ＯＲＦｌｂ开放阅读框相对保守，通常用作检测病毒的靶基因［４３］。目前，全球发表的ＣＡｓｔＶ逡逑全基因组序列仅６条，中国地区还没有ＣＡｓｔＶ分子流行病学调查和全基因组序列的相关报逡逑道。根据以往的报道，ＣＡｓｔＶ存在两种分类方法，一种是根据较为保守的ＯＲＦｌｂ开放阅读逡逑框编码的ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶部分序列分类为ＣＡｓｔＶ邋Ｉ型和ＣＡｓｔＶ邋ＩＩ型；另一种是逡逑以ＯＲＦ２开放阅读框编码的衣壳蛋白序列分类为ＣＡｓｔＶＡ型和ＣＡｓｔＶ邋Ｂ型，其中，ＣＡｓｔＶ逡逑

序列,同源性分析,系统发育树,基因序列

图１－２邋ＣＡｓｔＶ部分ＲｄＲｐ基因序列同源性分析逡?

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