MAP诱导内质网应激介导的巨噬细胞凋亡及其对小鼠感染M.bovis的影响

发布时间：2020-07-31 22:07

【摘要】：副结核(Paratuberculosis),也称为约翰氏病(Johne'sdisease),由鸟分枝杆菌亚种的副结核分枝杆菌(Mycobacteriumavium subspeciesparatuberculosis,MAP)引起,是一种重要且极为普遍的反刍动物疾病,造成严重的经济损失。但是由于该细菌分离纯化难度较大,至今还缺少中国MAP分离株及其基因组信息。巨噬细胞被认为是MAP感染早期的主要宿主细胞,巨噬细胞的凋亡直接影响着MAP在细胞内的存活情况。但是关于MAP感染巨噬细胞后是否会引起细胞凋亡尚不明确。牛结核病(bTB)是一种慢性传染性细菌疾病,主要在野生动物、家畜以及人类中发现。它是由牛分枝杆菌(M.bovis)引起,主要通过气溶胶感染。全世界约有10%的人结核病病例是由牛分枝杆菌引起的。M.bvis与MAP常常可以同时感染同一个牛场,但是关于这两种病原体混合感染的研究却相对较少。因此,研究MAP与M.bois混合感染的免疫机制可以为牛副结核病及结核病的防治提供科学依据。1.本研究首要任务是分离中国的MAP菌株。通过ELISA检测某省19个奶牛场的MAP抗体的阳性率,筛选阳性率高的奶牛场,追踪MAP抗体阳性的淘汰奶牛,进行组织病理学观察,用HPC处理直肠粪便进行MAP分离,通过抗染色进行纯度检测,通过PCR-REA的方法对MAP菌株进行分型,同时用高通量测序技术对MAP分离株进行全基因组测序,用SOAPdenovo对短片段进行组装,通过BWA对短片段进行匹配,用SAM工具筛选SNP和indel。使用MEGA制作进化树。本研究成功地从中国奶牛场中分离出两株MAP菌株,并确定了这两株菌株均为MAP-C,并且证明了中国MAP分离株2015WD-1和2015WD-2与国际参考株MAPK-10关系最密切。2.用不同MOI值(MOI=1,5,10)的MAP2015WD-1菌株感染巨噬细胞J774A.1,在感染后12h检测J774A.1的凋亡情况。结果表明,仅在MAP的MOI为10时,可以引起巨噬细胞的凋亡。因此,我们用MOI=10的感染复数感染J774A.1,使用内质网应激抑制剂4-PBA及内质网激动剂Tm预处理巨噬细胞,通过Western bloting、RT-PCR流式细胞术以及透射电镜等技术探究内质网应激是否参与了 MAP诱导的J774A.1的细胞凋亡。结果证明,MAP可以引起J774A.1的内质网应激,并且在用内质网应激抑制剂4-PBA预处理后,细胞凋亡减少,用内质网应激激动剂Tm预处理后,细胞凋亡增多,因而从正反两反面证明了内质网应激参与了 MAP诱导的凋亡。我们进一步研究了巨噬细胞的极化与内质网应激及凋亡的关系。用LPS、IFN-γ处理将J774A.1诱导分化为Ml巨噬细胞,用IL-4处理诱导分化为M2巨噬细胞,用MAP分别感染Ml和M2(MOI=10),在不同的时间点检测细胞凋亡及内质网应激情况。结果表明,M1比M2巨噬细胞更容易发生内质网应所介导的细胞凋亡。3.本研究构建了 MAP与M.bovis混合感染的小鼠模型,通过观察体重及死亡情况的变化以及组织病理学观察来评估MAP对小鼠感染M bovis进程的影响;通过ProcartaPlex Multiplex Immunoassay 检测小鼠在感染后 1,3 和 6 周血清中 TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-22,IL-13,IL-27,IL-23,IL-12P70,GM-CSF,IL-18和IL-17A的浓度变化;通过流式细胞术来探究脾脏及肺脏中CD4及CD8T细胞亚群的比例及脾脏中Th1/Th2反应、记忆性T细胞表型及多功能性T细胞的比例;通过免疫组化方法探究小鼠单独感染M.bovis与混合感染MAP之间肺脏中IFN-β的表达情况。结果表明提前感染MAP,可以抑制M.bovis感染小鼠的进程。对其产生影响的机制探究发现,MAP+ M.bovis小鼠可以通过减少肺脏中IFN-β的产量、诱导CD4+T细胞的产生、增强Th1反应以及增加脾脏中多功能性CD4+T细胞的数量来延长小鼠的存活时间或降低死亡率。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

谱系,基因组学,途径

ＡＦＬＰ进行再划分。ＡＦＬＰ分析与以往的研究相比，其显著特点是人类菌株表现出高逡逑度异质性。类似的研究表明，很多人的菌株对判定牛与人之间ＭＡＰ传播的可能性非逡逑常重要（图１－１）。例如，八聚体为基础的基因组扫描鉴定了在美国牛群中广为传播的逡逑大肠杆菌０１５７：邋Ｈ７的两个谱系［６］。这个分析显示，一些从牛和人类中获得的类型并逡逑不是随机分到谱系中的。这个表明，牛源的分离株对人没有致病性。相反，虽然人的逡逑分离株数目有限，但通过ＡＦＬＰ分析ＭＡＰ菌株，似乎与这个趋势不匹配［７］。如果牛逡逑的ＭＡＰ分离株不容易传播给人类，生牛奶或掺假牛奶作为ＣＤ病人ＭＡＰ感染的传逡逑染源将会很难维持（图１－１）。逡逑ＭＡＰ邋Ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｃｏｗ逡逑嫩，＝ｔｅ邋１逦—逡逑－逦＾逦＾邋ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ逦ｐａｓｔａｙ邋ｒｉｚａｔｉｏｉｉ，邋ｊ逡逑：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ逦ｓｏｒｒｍ邋ｂａｃｉｌｌｉ邋ｍｍａｉｎ逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋ＡＦＬＰ）逦（ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ邋ｍｉｌｋ）逡逑４逡逑ｎｐ逦Ｈｏｍａｎ逡逑：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ逦ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ逡逑ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ逦＊逡逑ｓｔｒａｉｎｓ邋＜ｅ．ｇ．邋ＡＦＬＰ）逡逑Ｖ逦＃逡逑Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ／邋Ｏｕｉｔｙｒｅ邋Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ／ｗｉｌｄｌｌｆｅ逡逑Ｗｉ，ｌＳｒＰ邋１＾＝邋ＣｅＪ＾Ｔｕｌ＾ｓ）逡逑图１－１ＭＡＰ传染给人的潜在途径（Ｃｈａｃｏｎ

溶酶体

和ＬＡＭＰ－３与次级内体的联合，反之，阻止ＭＡＰＫ－Ｐ３８信号引起吞噬体的酸化和次逡逑级内体标记物的富集。这意味着ＭＡＰＫ－Ｐ３８在吞噬溶酶体的生物起源中起到一个负逡逑调节的作用［５２］。（图１－２）逡逑，逦展：■：邋一逡逑图１－２邋ＭＡＰ抑制吞嗤溶酶体的成熟（Ｒｙａｎ邋Ｊ邋Ａｒｓｅｎａｕｌｔ，２０１４）逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ＭＡＰ逡逑１．２．３邋ＭＡＰ阻止巨噬细胞的应答逡逑Ｌ２．３．１模式识别受体逡逑模式识别受体（ＰＲＲｓ）在诱导宿主保护性反应中感知微生物感染中发挥作用。逡逑ＰＲＲｓ通过结合受体特异性的病原体相关分子模式（ＰＡＭＰｓ）而被激活。Ｔｏｌｌ样受体逡逑（ＴＬＲｓ）代表了一种主要的ＰＲＲ亚类。除了由不同种ＴＬＲｓ产生的标准的免疫诱导逡逑和细胞因子应答之外，其它的对分枝杆菌致病机理重要的细胞进程同样是由ＴＬＲ介逡逑导，包括吞噬体的成熟。在ＴＬＲ系统中成熟的个体表现出对多种感染的易感性增强，逡逑包括分枝杆菌［５３］。而且，ＴＬＲ对自然ＭＡＰ感染应答表达的动态水平提示着它在抵抗逡逑ＭＡＰ的机制中起作用［５４］。特定的ＴＬＲｓ的激活，如ＴＬＲ９，产生对抵抗ＭＡＰ至关重逡逑要的应答，然而，其它ＴＬＲｓ的激活，如ＴＬＲ２，诱导抑制抵抗ＭＡＰ的免疫防御反应。逡逑１．２．３．２邋ＴＬＲ９在巨噬细胞对ＭＡＰ产生免疫应答的作用逡逑虽然许多哺乳动物的ＴＬＲｓ参与到了控制分枝杆菌的感染中

炎性病变,细胞的,区域,小鼠

陷的小鼠中，存在过量的ＩＬ－１２ｐ４０，并且这种过量与树突状细胞向引流淋巴结的迁移逡逑增加和抗原特异性Ｔ细胞的诱导增加有关。这些小鼠也能比完整小鼠更好地控制Ｍｔｂ逡逑的生长［１（）６］（图１－５）。其他研究表明，表达趋化因子受体ＣＣＲ２的炎性单核细胞是细逡逑菌从肺移动到引流淋巴结所必需的［９４］。也许在ＩＬ－１２ｐ４０和ＣＣＲ２的趋化因子配体逡逑ＣＣＬ２之间存在重要的平衡。在具有ＣＣＬ２启动子多态性的人类中，应答于Ｍｔｂ的逡逑ＣＣＬ２的产量增加，并伴有ＩＬ－１２ｐ４０反应的减少［１（）７］。具有这种多态性的个体患结核逡逑病的发病率增加了

【参考文献】