褐黄血蜱热休克蛋白70家族的克

发布时间：2020-08-01 13:05

【摘要】：褐黄血蜱是我国常见蜱种之一,主要侵袭猪、犬、黄牛和刺猬等脊椎动物。它携带新布尼亚病毒、蜱传脑炎病毒和立克次体等多种病原体,具有潜在公共卫生意义。为筛选功能蛋白分子,探索新的控蜱方案,本研究采用LC-MS/MS技术分析褐黄血蜱中肠内容物主要蛋白组分,选定热休克蛋白70家族作为本研究内容;从褐黄血蜱唾液腺和中肠转录组文库搜索出热休克蛋白70 Unigenes,以RACE法进行全长;以实时荧光定量PCR法分析该家族五个成员在半饱血和饱血褐黄血蜱雌成虫唾液腺内的表达水平;以pGEX-4T-1制备HSP70-8重组蛋白,通过凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)凝血时间分析其抗凝活性及机制。主要结果如下:1.在褐黄血蜱中肠内容物中检出特异性肽段131个,鉴定蛋白102种,其中高可信度蛋白16种。从褐黄血蜱中肠转录组文库中搜出高可信度蛋白同源Unigene 24条,其中,9条Unigene编码的多肽为蛋白完整序列,其他均为蛋白的部分序列。目前仅能确定三种高可信度蛋白Vitellogenin-1、Vitellogenin-2和Histone H4由雌蜱分泌。2.从褐黄血蜱唾液腺和中肠转录组文库中搜出被注释为热休克蛋白70的Contig8235、Contig8804、Contig4468、Contig4254和Contig2393,以RACE法克隆获得四个热休克蛋白70 cDNA全长,即KY249381.1、KY678393.1、KY249380.1和KY249379.1,分别编码蛋白HSP70-2a、HSP70-2b、HSP70-5和HSP70-9。3.以实时荧光定量PCR法分析可知,热休克蛋白70家族五个成员在半饱血状态唾液腺的表达水平均高于在饱血状态唾液腺的表达水平,其中,HSP70-5、HSP70-8和HSP70-9差异显著(p0.01);在半饱血状态唾液腺内,相对表达量为HSP70-9HSP70-8HSP70-5HSP70-2aHSP70-2b;而在饱血状态唾液腺内,相对表达量为HSP70-8HSP70-9HSP70-5HSP70-2bHSP70-2a。4.以褐黄血蜱HSP70-8-ORF插入pGEX-4T-1构建重组载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白表达;经SDS-PAGE和Western-blotting法鉴定,成功获得相对质量为100 kDa的褐黄血蜱HSP70-8重组蛋白。5.HSP70-8重组蛋白能显著延长凝血酶时间(TT)(p0.01)和纤维蛋白原(FIB)凝血时间(300s),但对凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)无影响,证明该蛋白具有抗凝血活性。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.746
【图文】：

virus[42]；Yun 等人在该蜱检出了新布尼亚病毒（SFTSV）、蜱传脑炎病毒（T浆体（Anaplasma）等病原体[43]。蜱类消化特点和抗凝的重要性 蜱类以吸血为生蜱类的一个生活周期包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四个阶段，除卵期外，其他均须叮咬宿主、充分吸血才能完成进一步发育。硬蜱的各活动期均仅吸血一血时间较长，通常幼虫、若虫和雌虫吸血时间分别为 2～7、3～8 和 6～15后体重分别增加 10～20、20～100 和 50～250 倍。 抗凝是蜱类消化血餐的意义蜱类的消化系统主要由唾液腺和口器、咽峡、食管、中肠、小肠、直肠囊、等组成，其中，中肠是蜱消化血餐和吸收养分的主要部位。与其他动物不同行细胞内消化，这是一种十分独特的消化方式。蜱类消化血餐的过程见图 1

蜱类唾液中的主要抗凝分子及其作用机制见图 1-2。图1-2 蜱类唾液蛋白的抗凝机制（Chmelar et al. 2012）Fig.1-2Anticoagulant mechanisms of tick salivary proteins (Chmelar et al. 2012)

CTD），相对质量为 10 kDa 左右，约包含 100 个氨基酸残基且序列不保守前其生理功能尚不明确。从 HSP70 的立体结构看，其 NBD 由四个结构亚区组成叶，两叶之间即为 ATP 结合位点；SBD 包含两个亚区，中间呈袋状，形成底物位点，SBD 与 NBD 之间通过一段铰链区连接；在 CTD 区域，肽链形成“盖子构，能阻止已结合的底物脱离[103]。除 NBD、SBD 和 CTD 三个功能域外，HSP70 家族成员均含有不同的定位序SP70-5 和 HSP70-9 等家族成员在 N- 末端具有定位信号（Localization signal），其蛋白质分子的细胞间区域；HSP70-1a、HSP70-1b、HSP70-1t、HSP70-2、HSP70SC70 等蛋白分子的 C- 末端均有特殊定位基序（motif）EEVD，表明它们都定位胞质/细胞核（Nu/Cyto）；HSP70-5 蛋白分子的 C- 末端含有滞留信号（Retengnal）KEDL，可以阻止该蛋白离开内质网[104]。已经证明，HSP70 家族的亚细胞不相同，它们在不同生理条件下发挥的生物学功能也不同[105]。总结人类 HSP70的已知结构域见图 1-3。

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本文编号：2777497