猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

发布时间：2020-08-02 13:51

【摘要】：猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的冠状病毒,主要引起仔猪腹泻,呕吐和脱水。PDCoV自2012年在中国香港首次报道以来在世界多国迅速扩散,给养猪业造成了巨大的经济损失。由于该病毒在近几年新发,尚无有效的疫苗及商品化的检测、诊断方法和试剂盒。本研究旨在利用表达纯化PDCoV N蛋白建立一种检测该病原抗体的间接ELISA检测方法,为临床上检测、诊断PDCoV感染提供有效的依据。为获得高纯度PDCoV N蛋白,本研究从PDCoV cDNA中利用PCR技术扩增获得N基因的核酸,目的片段经酶切处理后克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序验证后命名为rPDCoV-N。将重组质粒rPDCoV-N转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析及Western-blot鉴定。结果表明,目的蛋白在表达体系中被成功表达,其蛋白分子量大小为50.4 KDa。此后,对IPTG诱导浓度、诱导温度及表达时间等进行优化,并采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果表明,本研究获得了大量高纯度PDCoV N蛋白,可用作本研究ELISA的包被抗原。采用纯化的重组N蛋白为包被抗原,PDCoV感染的阳性猪血清为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG为二抗,建立了检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。此后,本研究从抗原包被浓度、包被温度、封闭液浓度及封闭时间、一抗稀释度及孵育时间、二抗稀释度及孵育时间、显色时间等方面对ELISA检测条件进行了优化,获得了如下最佳反应条件:抗原的最佳包被量为100 ng/孔,抗原的最佳包被温度及时间为4℃、1h,最佳封闭物浓度、温度及时间分别为2.5%BSA、37℃、1h,一抗最佳稀释度为1:25,一抗最佳孵育时间为37℃1.5h,二抗最佳稀释浓度为1:5000,二抗的最佳孵育时间为1.5h,最佳显色时间为5min。由此可见,本研究已初步建立了基于PDCoV-N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为临床上对猪群PDCoV感染的监测和流行病学调查提供了技术保障。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

电镜图,病毒粒子,电镜,非结构蛋白

图 1-1 病毒粒子电镜图Fig.1-1 Electron micrographs of PDCoVPDCoV 是有囊膜单股正链 RNA 病毒，其基因组全长约为 25.4 kb[14]，成熟的非结构蛋白、4 个结构蛋白和 3 个辅助蛋白[15, 16]，具有 5’端帽oly（A）尾巴结构，在已知冠状病毒中其基因组最小[16]。PDCoV 的基包含 5’非翻译区（UTR）、ORF1a、ORF1b、表面纤突蛋白（Spike, 蛋白（Envelope, E）、膜蛋白（Membrane, M）、非结构蛋白 6（Nsp白（Nucleocapsid, N）非结构蛋白 7（Nsp7）和 3’-UTR[17]。最近，也道在 Nsp7 中又新发现一个蛋白 Nsp7a[18]（图 1-2）。其中，ORF1b 占编码两个重叠复制多聚蛋白的基因组的三分之二，编码两个病毒聚蛋白 pp1a 和 pplab[11]，它们被蛋白酶水解切割成 15 个成熟的非结构sps），其中，主要是与病毒复制转录有关的蛋白酶包括 Nsp3（木瓜蛋）、Nsp5（糜蛋白酶，3CLpro）、Nsp12（RNA 依赖的 RNA 聚合

基因组结构

甘肃农业大学 2018 届硕士学位论文颗粒的装配与 M 蛋白的一级结构域是密不可分的[22]。N 蛋白主要在病毒复制的初期产生，在病毒复制和发病机制中发挥重要的作用[23]。辅助蛋白 NS6 主要位于基因组中结构蛋白 M 和 N之间[24]，在冠状病毒复制的早期阶段发挥作用，可以激活细胞自噬[25]。而 NS7 主要位于 N 基因内的另一 ORF 中，编码 200 个氨基酸[26]。预测的辅助蛋白质广泛分布于整个冠状病毒的基因组中并且具有物种特异性。先前有研究表明，冠状病毒中所含有的辅助蛋白虽然对于体外病毒复制是非必需的，但是冠状病毒中辅助蛋白的存在对于病毒的致病机制和体内的免疫调节相关联[27, 28]。两个辅助基因即 Nsp6 和 Nsp7分别位于 N基因的上游和一段。Nsp7a 由具有非规范转录调控序列的单独的亚基因组 mRNA 编码，但其作用并不清楚。

冠状病毒,转录调控序列,非规范,亚基因组

冠状病毒中所含有的辅助蛋白虽然但是冠状病毒中辅助蛋白的存在对于病毒的致[27, 28]。两个辅助基因即 Nsp6 和 Nsp7分别位于具有非规范转录调控序列的单独的亚基因组 m图 1-2 PDCoV的基因组结构Fig.1-2 The genomic structure of PDCoV

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