微小隐孢子虫TSP7蛋白质通过硫化肝素介导子孢子对HCT-8细胞的黏附

发布时间：2020-08-02 17:55

【摘要】：微小隐孢子虫是一种肠道寄生虫,属于顶复门原虫,是导致全球腹泻病的主要病原之一。对于隐孢子虫病,缺乏有效的治疗药物,部分原因是隐孢子虫与宿主细胞之间互作机制了解太少,为此,寻找微小隐孢子虫黏附及入侵宿主细胞的相关分子显得十分关键。研究发现,顶复门寄生虫在入侵宿主细胞时是一个连续的过程,其必要条件是寄生虫的多种分子(配体)与宿主细胞表面的分子(受体)结合,进而入侵宿主细胞。肝素类糖胺聚糖分子是一类重要的黏附受体,其能够显著抑制虫体对宿主细胞的黏附入侵。本研究中选取了与之前报道的TRAP蛋白家族里的TRAP-C1和TSP8结构相似微小隐孢子虫TSP7蛋白质作为研究对象,对其进行亚细胞定位和相关黏附功能研究。首先通过生物信息学分析,合成一段特异性好、免疫原性强的多肽序列“361QISQWTDWSTC371”,分别偶联至载体蛋白KLH和BSA上,分别用于免疫动物和ELISA检测,制备了抗TSP7单克隆抗体。通过间接免疫荧光的方法,利用单抗对TSP7蛋白质进行亚细胞定位。通过Western blot的方法,对子孢子中的TSP7天然蛋白质进行鉴定。通过荧光定量PCR的方法,分别提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子及细胞内不同时期的总RNA,对TSP7基因的转录水平进行分析。为了进一步研究TSP7的相关黏附功能,利用原核表达系统表达重组蛋白质TSP7-GST,通过Western blot、间接免疫荧光、流式细胞术三种试验方法分析TSP7-GST与HCT-8细胞的黏附情况。通过重组TSP7-GST蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制该重组蛋白质与肝素磁珠结合试验及肝素钠盐抑制重组蛋白与HCT-8的结合试验,验证硫化肝素作为该重组蛋白结合HCT-8的主要受体。最后,通过荧光定量PCR的方法评价抗TSP7单抗阻断虫体入侵HCT-8的效果。生物信息学分析结果表明TSP7蛋白质N端为信号肽,C端为跨膜区,含有3个TSP1结构域,1个EGF样结构域,4个肝素结合基序。间接免疫荧光实验结果表明TSP7蛋白质位于微小隐孢子虫子孢子与裂殖子表膜,且能够与微小隐孢子虫已知膜蛋白Gp15共定位。Western blot结果表明anti-TSP7单抗能够特异性识别大小为125 KDa的虫体天然蛋白。以虫体Cp18S为内参,进行荧光定量PCR,结果表明TSP7基因在各时期均有转录,在虫体入侵HCT-8细胞12 h时转录水平达到最高。通过原核表达系统表达并纯化出可溶性重组蛋白质TSP7-GST,利用流式细胞术、间接免疫荧光、细胞ELISA分析该重组蛋白质与HCT-8的结合情况,结果表明与对照组(标签蛋白质GST)相比,TSP7-GST能够与HCT-8结合,结合曲线呈剂量依赖性和可饱和性。进一步研究发现,TSP7-GST能够与肝素磁珠结合,且这种结合受到肝素钠盐的竞争性抑制,表明这种结合是特异性的,而且不同浓度肝素钠盐能够抑制TSP7-GST与HCT-8细胞的结合。最后,单抗阻断结果表明,单抗能够显著阻断虫体入侵HCT-8细胞,并呈现剂量依赖性,当抗体浓度达到100μg/m L时,抑制率达到48%。综上,TSP7蛋白质在虫体与宿主细胞的互作方面扮演重要角色,可通过结合HCT-8表面的硫化肝素介导虫体的黏附和感染,有望成为防治隐孢子虫病的一个潜在的药物靶标及疫苗候选抗原。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.723
【图文】：

TSP7 第 1-34 个氨基酸为信号肽，编码区含有 3 个 TSP1 结构域，1 个EGF-like 结构域。用网站 swissmodel.expasy.org 对 Cgd5_4470 空间结构进行分析，图 1.3 所示，红色括号、红色箭头所示分别为 Loop 区多肽序列和三维结构模型，方框为所选序列的 B 细胞表位预测值。多肽序列为：361QISQWTDWSTC371。图 1.1 微小隐孢子虫 TSP7 结构示意图Fig1.1 Sche

P7 空间结构，三维模型及 B 所选择的多肽序列，方框为f TSP7 spatial structure, 3D mows indicate the selected polypted value of the B cell epitope ，偶联的多肽-BSA 经 10%SD其分子量变大，其相对分子

图 1.2 TSP7 空间结构，三维模型及 B 细胞表位分析色的括号及箭头所示为所选择的多肽序列，方框为该序列 B 细胞表位预测Fig 1.2 Analysis of TSP7 spatial structure, 3D model and B cell epitopeThe red brackets and arrows indicate the selected polypeptide sequence, and the is the predicted value of the B cell epitope of the sequence.3.2 多肽偶联的鉴定利用 MBS 偶联方法，偶联的多肽-BSA 经 10%SDS-PAGE 分析，如图 1.3，偶联至载体蛋白上后其分子量变大，其相对分子质量为 100 KDa 左右， BSA 偶联成功。

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本文编号：2778861