食欲素A通过cAMP-PKA信号通路调节绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮

发布时间：2020-08-03 07:48

【摘要】：为了探寻c AMP-PKA信号通路介导的食欲素A对绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮的影响。本试验以绵羊卵巢为研究对象,抽取卵泡颗粒细胞进行体外培养,以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定后,对颗粒细胞联合添加LH(2.5IU/ml)、FSH(2.5IU/ml)、E2(1ug/mL)处理24h使其黄体化。添加10 nmol/L和50 nmol/L的食欲素A处理24 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测绵羊卵巢黄体化颗粒细胞上清液中孕酮浓度;收集细胞,ELISA检测绵羊卵巢黄体化颗粒细胞中cAMP的浓度。在卵巢黄体化颗粒细胞中添加添加不同浓度的食欲素受体抑制剂(Almorexant)(10 nmol/L,100 nmol/L,1μmol/L)孵育2 h,添加不同浓度(10 nmol/L,50 nmol/L)的食欲素A孵育24 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测细胞裂解上清中c AMP浓度变化;western blot检测细胞中St AR,以及PKA蛋白的表达量。分别添加Almorexant,食欲素受体激活剂(Orexin Receptor Agonist),PKA抑制剂(H-89),分别检测细胞中StAR以及PKA蛋白表达量的变化,以及细胞中cAMP的浓度变化。结果表明,HE染色镜下可见梭形或不规则星形的卵巢黄体化颗粒细胞,胞核与胞浆着色均匀,细胞核呈蓝紫色,胞浆呈淡粉色。免疫荧光结果显示FSHR呈阳性表达。绵羊卵巢黄体化颗粒细胞添加食欲素A,同一时间孕酮分泌量随食欲素浓度的增加呈逐渐升高然后下降的趋势,且浓度10 nmol/L时孕酮分泌量达到最高;添加同一浓度的食欲素A,随着作用时间的延长孕酮分泌量呈逐渐升高然后下降的趋势,且在24 h时分泌量达到最高。添加Almorexant与对照组相比cAMP的浓度显著降低(P0.01)。通过检测Almorexant、Orexin Receptor Agonist、H-89对卵巢黄体化颗粒细胞内PKA及St AR蛋白表达的影响中发现,与对照组相比,orexin A组St AR和PKA蛋白的表达量显著升高(P0.05);在添加食欲素受体激活剂Orexin Receptor Agonist后再添加orexin A,黄体化绵羊颗粒细胞中St AR和PKA蛋白的表达量显著增加(P0.001);添加抑制剂组黄体化绵羊颗粒细胞中St AR和PKA蛋白的表达量显著减少;添加H-89组颗粒细胞中StAR和PKA蛋白的表达量显著减少(P0.05)。综上所述,orexin A能够通过与其受体相结合,通过cAMP-PKA信号通路促进绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826
【图文】：

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图 1 绵羊卵巢颗粒细胞Figure 1 Ovian granulosa cells注：A:原代绵羊卵巢颗粒细胞 B:F1 代绵羊卵巢颗粒细胞C: F2 代绵羊卵巢颗粒细胞 D: F3 代绵羊卵巢颗粒细胞颗粒细胞鉴定结果形态完整，边缘清晰（见图 2-A）。HE 染色后，镜下可见细，分布均一，多呈梭形或不规则星形。胞浆呈淡红色，细胞形（见图 2-B）。的荧光化学染色是鉴定颗粒细胞简便快速的方法，FSHR 阳呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。镜下可见与对照组相比此表明体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞纯度已经达到9D）。

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图 2 FSHR 在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达Fig 2 Sheep ovarian granulosa cells expressing FSHR in vitro注：A 为原代培养 24h 颗粒细胞 B 为 HE 染色卵巢颗粒细胞C1 为实验组 FSHR 绿色荧光 C2 为实验组核染 C 为 C1 和 C2 共染D1 为对照组绿色荧光 D2 为对照组核染 D 为 D1 和 D2 共染周期同步化处理及检测结果培养绵羊卵巢颗粒细胞，传至第三代，分别经过血清饥饿处理 12h，用流式细胞仪分析对照组和两个处理组细胞的周期相，然后研究卵巢化处理后细胞时相的改变。结果显示，空白对照组，血清饥饿处理，和理组 G0+G1 期卵巢颗粒细胞的百分率分别为 65.2%，79.3%和 88.1%饿处理和 TdR 双阻断法均能将卵巢颗粒细胞很好的同步于 G0 期和 G断法的同步化效率更高，有利于使后续黄体化处理试验保持一致性。

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图3 细胞周期检测结果Fig 3 The results of ovarian granulosa cells4.4 卵巢颗粒细胞黄体化结果从表 8 及图 4 分析可知，用 FSH、LH、E2 刺激 24 h 后，FLE 组与 no FLE 组相比，孕酮表达量显著升高（P＜0.01），表明此卵巢黄体化颗粒细胞已被黄体化。表8 黄体化处理后孕酮分泌量结果统计Table 8 The of secretion progesterone after luteal treatment时间对照组处理组NO FLE FLE0 h 2.8a±0.7 9.1b±0.224 h 4.2A±2.0 24.3B±0.4注：右上角标有不同小写字母的数据之间差异显著（P<0.05），标有不同大写字母的数据之间差异极显著（P<0.01）下同。No FLE：颗粒细胞 FLE：黄体化颗粒细胞空白对照血清饥饿处理组

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