猫杯状病毒感染抑制Ⅰ型干扰素信号通路的分子机制

发布时间：2020-08-03 14:48

【摘要】：固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线,宿主的模式识别受体能够对病原相关分子模式进行识别,进而激活固有免疫系统,最终释放干扰素和炎症因子等一系列细胞因子通过抗病毒或参与炎症反应等发挥作用。I型干扰素可以通过JAK/STAT通路激活数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)转录表达,从而发挥抗病毒作用。而病毒也进化出了许多对抗宿主抗病毒反应的策略,尤其是对抗宿主的固有免疫系统。因此研究固有抗病毒免疫和病毒对固有免疫系统的抑制,对于基础研究和临床应用都有很大的意义。猫杯状病毒(FCV)是杯状病毒科,水疮性病毒属(Vesivirus)成员,感染猫后可引起上呼吸道疾病和急性口腔炎溃疡,病情严重的,可引起感染猫的死亡。同病毒科的人诺如病毒是引起急性胃肠炎和腹泻最重要的病原之一。目前还没有对抗人诺如病毒的有效药物和疫苗,主要原因是一直以来人诺如病毒的体外培养技术都不成熟。此外杯状病毒与宿主免疫系统的相互作用研究相对较少,FCV体外培养技术比较成熟,是目前研究人诺如病毒最好的模式病毒之一,研究FCV与固有免疫系统的关系对整个杯状病毒科的研究都有很重要的意义。本研究首先应用蛋白质组学技术筛选FCV感染CRFK细胞前后的差异表达蛋白,共筛选到差异蛋白429个,其中229个蛋白表达量升高,有200个蛋白表达量降低;与固有免疫相关的蛋白有IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等,且这些蛋白表达量都发生了不同程度的下调;其中IFNAR1为I型干扰素受体组分,IRF1为I型干扰素信号通路重要调控分子,该发现为FCV抑制I型干扰素通路研究奠定基础。其次,通过IFN-α抗病毒试验,发现IFN-α不能够抑制FCV复制,Western blot和流式细胞术结果表明FCV感染后下调了IFNAR1在细胞表面的表达量,qRT-PCR、半定量PCR和Northern blot结果表明FCV感染后IFNAR1的mRNA表达量减少,最终发现FCV非结构蛋白PP和p30可以抑制共转染质粒的表达,且PP和p30转染后可以使IFNAR1的mRNA表达量降低。此外,克隆了猫源IRF1(Fe-IRF1),瞬时转染Fe-IRF1后可以显著抑制FCV的复制。双荧光素酶试验结果表明Fe-IRF1通过激活I型干扰素通路发挥抗病毒作用;Western blot结果表明FCV感染可以下调IRF1蛋白表达量;qRT-PCR结果表明FCV感染可以下调IRF1的mRNA表达量。总之,本研究应用差异蛋白质组学方法,筛选到FCV感染后下调表达的固有免疫相关蛋白IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等;FCV感染后可以通过下调IFNAR1的mRNA表达,阻断I型干扰素通路发挥作用;FCV感染后同时可以下调IRF1的mRNA水平,抑制I型干扰素通路发挥作用。最终FCV可以通过两种方式抑制I型干扰素信号通路的抗病毒作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

病毒粒子,网站,模式图,博士学位论文

科学院博士学位论文第一章度为 1.37-1.42 /cm3。V 对乙醚、氯仿以及温和的洗涤剂不敏感，酸度为 pH=3 时不稳定，pH=4-5 时稳定即可使病毒丧失感染能力。1~2 mol/LNaCl 可以提高病毒的耐热性，然而 MgCl2可(黄倩倩等., 2015)，2% NaOH 可以有效的灭活病毒，FCV 对干燥和紫外线也很敏

模式图,基因组,模式图

图 1.1 FCV 病毒粒子模式图（引自 viralzone 网站）Figure 1.1 Schematic of FCV Virion（cited from the viralzone website） FCV 基因组CV 的基因组为一条单股正链不分节段的 RNA 分子，大小在 7.7kb 左右，在其 5’端结合有接蛋白 VPg，VPg 之后是 5’-UTR，随后是三个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF ORF1、ORF2 和 ORF3（图 1.2）。CV 的 ORF1 位于基因组 RNA 的 5’端，起始位点是从第 20 位到第 5311 位核苷酸，是位R 后的第一个 ORF，ORF1 编码 FCV 的非结构蛋白，ORF1 首先翻译出一个 200 kDa 的多随后在蛋白酶聚合酶（Protease Polymerase, PP）的作用下能够将多聚蛋白切割成单独非，FCV 共有 7 个非结构蛋白，从左到右大小依次为 5.6 kDa、32 kDa、38.9 kDa、30.1 kDDa 和 75.7 kDa ，它们分别被命名为 p5.6、p32、p39(NTPase)、p30、p13（VPg）、p76（Pro-Po玉等., 2010)(Sosnovtsev et al., 2002)。CV 的 ORF2 和 ORF3 分别编码主要结构蛋白 VP1 和次要结构蛋白 VP2。VP1 和 VP2 是基因组基因翻译得到的。ORF2 编码的衣壳蛋白前体大小约为 73 kDa，被 PP 切割成一a 大小的衣壳蛋白前导区和衣壳蛋白成熟区 VP1，大量成熟的 VP1 加上少量 VP2 能够与g 的病毒基因组共同组装得到完整的有感染性的病毒粒子。

分区图

125 aa之间的位点进行切割，除去N末端的124aa后形成62 kDa的成熟衣壳蛋白VP1(Ca 1992)，PP 对 VP1 蛋白前体的切割非常快，只有当切割被抑制的时候，VP1 蛋白前体才测到，例如在培养基中添加蛋白酶抑制剂，或者是在较高温度条件下培养 FCV 才能够VP1 前体(Carter, 1989)。VP1 蛋白前体最早在病毒感染 2 h 就能够检测到，但是蛋白很快 62kDa 的成熟衣壳(Carter, 1989)。此外 VP1 还能够在细胞内被切割出一条 40 kDa 左右这种切割是依赖半胱天冬酶的，至于具体切割的机制和用途暂时还不明确(Carter et al., 19ts et al., 2003a)。成熟的 VP1 和 VP2 与基因组结合可以自动组装成病毒粒子，实验室真核VP1 可以自动组装成病毒样粒子（Virus-like particle，VLP），但是这种 VLP 在形态和大小的病毒粒子有一些差异，它的表面是平滑的，并没有杯状的凹陷，不过这样的 VLP 有原性，能和 FCV 阳性血清发生良好的反应，同时在免疫家兔后能够诱导产生高滴度的，能和多株临床分离的FCV流行毒株发生反应，可以作为FCV的候选疫苗(Di Martino et 。据不同 FCV 病毒株之间的相似性，FCV 的衣壳蛋白 VP1 可分为六个区域：A、B、C、D区，以 FCV 2280 株为例，A 区位于 1-124 aa，也就是 VP1 前体被切割掉的 VP1 前导区， 125-397aa，B 区内包含一个潜在的肉豆蔻化甘氨酸和 ATP/GTP 结合位点，C 区、E 区，分别位于 398-401 aa 和 427-524 aa 之间，他们含有中和抗原表位，F 区位于 525 aa～6，含有非中和抗原表位(Neill et al., 1991; Seal and Neill, 1995)（图 1.3）。

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