【摘要】：三甲基甘氨酸可以促进脂肪分解酶表达以及抑制脂肪合成相关酶表达,从而降低猪背膘厚,减少皮下脂肪；同时,三甲基甘氨酸可缓解高脂引起的肝脏脂肪变性以及脂肪组织功能紊乱。目前,关于三甲基甘氨酸作用机制的研究发现,三甲基甘氨酸调节脂肪沉积与AMPK关系密切。但是三甲基甘氨酸是否通过激活AMPK,进一步影响其下游信号通路,从而发挥降低机体脂肪沉积的作用还有待深入研究。因此,本试验以AMPKα1敲除小鼠为模型,利用高脂饲料诱导肥胖,首先在体内试验中,研究了三甲基甘氨酸对高脂诱导的野生型和AMPKα1敲除小鼠体增重、血液指标、肝脏和脂肪组织脂肪沉积的影响；在此基础上,利用knockdown AMPKα1、激活或抑制AMPK活性以及利用甲基化抑制剂等方法,在体外细胞试验中,深入探讨了三甲基甘氨酸通过激活AMPK通路来缓解动物机体脂肪沉积的可能机制。主要研究结果如下：试验一：三甲基甘氨酸对高脂诱导的小鼠体增重和血液指标的影响本试验构建了AMPKα1敲除小鼠模型,并对比研究了三甲基甘氨酸对高脂诱导的野生型和AMPKα1敲除小鼠体增重、血脂水平和与脂肪代谢相关激素水平的影响。体增重：野生型和AMPKα1敲除小鼠的体增重无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高了体增重(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则缓解了高脂诱导的体增重增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高了体增重(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸对高脂诱导的体增重增加无缓解作用；血液甘油三酯和游离脂肪酸：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则缓解了高脂诱导的TG和FFA水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高了血液中TG和FFA水平(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸对高脂引起的TG和FFA水平变化无缓解作用。脂肪代谢相关激素水平：野生型和AMPKα1敲除小鼠血液中胰岛素和瘦素水平无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高了血液中胰岛素和瘦素水平(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸则显著缓解了高脂诱导的胰岛素和瘦素水平升高(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高了血液中胰岛素和瘦素水平(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸对高脂诱导的激素水平变化无缓解作用。以上结果提示三甲基甘氨酸可降低小鼠体增重、降低血脂和激素水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸发挥这些作用过程中起关键作用。试验二：三甲基甘氨酸对高脂诱导小鼠机体脂肪沉积的影响及初步机制研究在上述体重和血液指标研究的基础上,进一步研究了三甲基甘氨酸对高脂诱导的野生型和AMPKα1敲除小鼠脂肪沉积的影响,结果如下：在肝脏组织脂肪沉积方面：组织切片油红O染色显示：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝脏脂肪沉积无差异；在野生型小鼠中,高脂诱导提高了肝脏脂肪沉积,而高脂组加入三甲基甘氨酸则缓解了高脂诱导的肝脏脂肪沉积；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也提高了肝脏脂肪沉积,但高脂组加入三甲基甘氨酸对高脂诱导的肝脏脂肪沉积无降低作用。线粒体功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝脏线粒体功能(PGC1α)和脂肪酸氧化(CPT1a)相关蛋白表达无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著降低了肝脏PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则显著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著降低了肝脏PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸提高了PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05)。本试验室前期研究发现m6A甲基化水平与脂肪沉积成正相关,而三甲基甘氨酸是重要的甲基供体,因此我们进一步检测了肝脏中m6A甲基化水平以及去甲基化酶FTO蛋白表达：野生型和AMPKα1敲除小鼠肝脏FTO蛋白表达和m6A甲基化水平无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高了肝脏FTO蛋白表达(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸显著缓解了高脂诱导的FTO蛋白表达和m6A甲基化的变化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高了肝脏FTO蛋白表达(P0.05),降低了m6A甲基化水平(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸显著缓解了高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表达的变化(P0.05)。在附睾脂肪组织脂肪沉积方面：附睾脂肪组织含量：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睾脂肪组织含量无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高附睾脂肪组织含量(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则显著缓解了高脂诱导的附睾脂肪组织含量的增加(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高了附睾脂肪组织含量(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸则对高脂诱导的附睾脂肪组织含量的增加无缓解作用。线粒体功能和脂肪酸氧化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睾脂肪组织PGC1α和CPT1a蛋白表达无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著降低了附睾脂肪组织PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则显著提高了PGC1α和CPT1a蛋白表达(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著降低了PGC1α和CPT1α蛋白表达(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸对PGC1α和CPT1a蛋白表达无显著影响。FTO蛋白表达和m6A甲基化：野生型和AMPKα1敲除小鼠附睾脂肪组织FTO蛋白表达和m6A甲基化水平无显著差异(P0.05)；在野生型小鼠中,高脂诱导显著提高了FTO蛋白表达(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),而高脂组加入三甲基甘氨酸则显著缓解了高脂引起的FTO蛋白表达和m6A甲基化水平的变化(P0.05)；在AMPKα1敲除小鼠中,高脂诱导也显著提高FTO蛋白表达(P0.05),降低m6A甲基化水平(P0.05),但高脂组加入三甲基甘氨酸对高脂引起的m6A甲基化和FTO蛋白表达无显著影响。以上结果提示三甲基甘氨酸显著降低肝脏和附睾脂肪组织的脂肪沉积,显著提高肝脏和附睾脂肪组织线粒体功能、脂肪酸氧化和m6A甲基化水平,且AMPKα1在三甲基甘氨酸发挥这些作用过程中起关键作用。试验三：三甲基甘氨酸降低脂肪细胞脂肪沉积的AMPK机制研究在上述体内试验初步证明了AMPKα1在三甲基甘氨酸降低脂肪沉积的作用中起关键作用,在此基础上,本试验利用分离得到的小鼠附睾脂肪细胞,进一步通过体外试验验证三甲基甘氨酸通过激活AMPK通路来降低脂肪组织脂肪沉积的可能机制。在脂肪细胞中knockdown AMPKα1:三甲基甘氨酸可以显著降低脂肪细胞的脂肪沉积,提高脂肪细胞CPT1α釉PGC1α蛋白表达和m6A甲基化水平(P0.05)；但knockdown AMPKα1后,三甲基甘氨酸对脂肪细胞的脂肪沉积,CPT1a, PGC1α和FTO蛋白表达以及m6A甲基化水平均无显著影响(P0.05)。在脂肪细胞中激活或抑制AMPK活性：为进一步探究AMPK和m6A甲基化的关系,在脂肪细胞中激活AMPK显著降低了FTO蛋白表达水平(P0.05),显著提高了脂肪细胞m6A甲基化水平(P0.05)；但抑制AMPK对m6A甲基化和FTO蛋白表达水平无显著影响(P0.05)。在脂肪细胞中抑制甲基化反应：为进一步了解甲基化反应是否是三甲基甘氨酸发挥作用的重要途径之一,利用Neplanocin A (NPA)处理脂肪细胞发现抑制甲基化反应后,脂肪细胞mRNA m6A甲基化水平显著降低(P0.05)；三甲基甘氨酸显著降低了脂肪细胞脂肪沉积(P0.05),但抑制甲基化反应后,三甲基甘氨酸对脂肪细胞脂肪沉积无显著影响(P0.05)。以上结果提示三甲基甘氨酸可能是通过激活AMPK活性,降低FTO表达,提高m6A甲基化水平来降低脂肪细胞脂肪沉积,AMPKα1在其中起关键作用。综上所述,三甲基甘氨酸可以激活AMPKα1,进一步提高脂肪酸氧化,线粒体功能以及m6A甲基化水平,从而发挥降低体脂沉积的作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816
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