MTHFR基因多态性与公猪精液品质的相关性的研究

发布时间：2020-08-03 15:51

【摘要】：公猪精液品质直接影响母猪受胎率、产仔数及后代质量,对猪场生产性能和经济效率至关重要。有研究报道,5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因缺陷会引起机体同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高,诱导产生氧化应激,并导致精子发生障碍及不育,是叶酸与Hcy代谢中的重要酶,对于调节细胞内的叶酸水平、DNA合成和甲基化具有重要作用。本论文旨在建立和检测公猪精液和血浆Hcy含量、精浆过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,研究MTHFR基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与不同品种公猪精浆中的H_2O_2水平和MDA水平的相关关系,以期筛选公猪精子MTHFR基因的SNP位点作为早期预警公猪精液品质的生物标志,为公猪站提前淘汰劣质公猪提供理论依据。主要研究结果如下:1)公猪精子Hcy含量与液品质的关系:试验选取健康的杜洛克、长白、大白49头,根据记录的精子密度、有效精子数和精子活力将49头公猪分为精液品质优(精子活力80%且精子畸形率10%)和差(精子活力70%或精子畸形率20%)2组。其中精液品质优的公猪33头,差的16头。精液品质差的组精子密度、有效精子数和精子活力均显著低于精液品质优的组公猪(P0.01),而精子畸形率显著高于精液品质优的组公猪(P0.01)。利用高效液相色谱法检测血浆和精子的Hcy水平,并分析其与公猪精液品质的关联性。结果表明,精液品质差的组公猪精子Hcy含量显著高于精液品质优的组公猪(P0.01),但血浆Hcy含量无显著差异(P0.05)。2)公猪精子MTHFR基因多态性与精液品质的关系:根据公猪站记录选取采样前3个月公猪精液利用率为100%的公猪中精液品质最好(主要是精子活力高和畸形率低,精子活力90%和精子畸形率5%)的公猪20头,以及利用率小于60%的公猪中精液品质最差(主要是精子活力低和畸形率高,精子活力75%和精子畸形率15%)的公猪20头。分别采样提取精子DNA和扩增MTHFR外显子片段。然后将40头公猪各片段的PCR原液混合,通过一代测序技术,鉴定公猪精子MTHFR外显子上的SNP位点。结果表明:公猪精子MTHFR基因外显子上共存在13个SNP位点,其中两个导致编码氨基酸改变;与人的MTHFR基因的SNP位点相比,有7个位点是一致的,没有发现与人不育症相关的MTHFR 677CT的相似位点。采集945头杜洛克公猪、459头长白和86头大白公猪的精液样品,利用高通量SNP分型技术对1490头公猪精子样品的MTHFR的基因SNP位点进行检测,并与精液量、精子密度、总精子数、有效精子数、精子活力、精子畸形率等指标进行了关联分析。结果表明:杜洛克公猪c.450CT位点与精子活力显著相关(P0.05);c.294CT位点与总精子数和有效精子数都显著相关(P0.05)。长白公猪c.450CT位点与精液量显著相关;c.450CT位点与精子密度显著相关;c.1278GA、c.1041GA、c.570CT和c.414CG位点不仅与精子密度显著相关,还与精子畸形率显著相关(P0.05)。没有发现SNP位点与大白公猪精液品质相关。对长白公猪符合哈达温伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的6个位点和大白公猪符合哈代温伯格定律的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.450CT、c.414CG的7个位点进行基因连锁不平衡分析。结果表明:长白公猪精子MTHFR外显子上的6个SNP位点构成2个单倍型模块,模块1的c.1485AG和c.1287AG位点处于强连锁不平衡状态(D’0.8,r~20.33);模块2的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、和c.414CG的4个SNP两两之间均处于强连锁不平衡状态(D’0.8,r~20.33);大白公猪精子MTHFR外显子上的7个SNP构成1个单倍型模块,模块中的c.1485AG、c.1287AG、c.1278GA、c.1041GA、c.570CT的5个SNP位点两两之间均处于强连锁不平衡状态(D’0.8,r~20.33)。3)试验选取170头长白公猪,检测了精浆中的H_2O_2和MDA水平,并与MTHFR基因的SNP位点进行关联性分析。结果表明:长白公猪MTHFR的c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位点不同基因型精浆中的H_2O_2水平和MDA水平存在显著性差异。综上所述,本研究主要结论如下:精液品质差组公猪精子Hcy含量显著高于精液品质优组公猪,但血浆Hcy含量无显著差异。长白公猪MTHFR c.1278GA、c.1041GA、c.570CT、c.414CG和c.294CT位点不同基因型不仅与精液品质存在显著性差异,还与精浆中的H_2O_2水平和MDA水平存在显著性差异,因此这些位点的多态性可能作为潜在的预测长白公猪精液品质的生物标记。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828.3
【图文】：

标准曲线,标准曲线,公猪

图 1-2 高效液相法测定 Hcy 标准曲线Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC子 Hcy 含量与精液品质关联分析精液品质差和精液品质优的公猪共 49 头，检测各组公猪发现，精液品质差组公猪精子密度、有效精子数和精子活公猪（P < 0.01），而精子畸形率显著高于精液品质优组公质组公猪机体 Hcy 含量检测发现，精液品质差组公猪精质优组公猪（P < 0.05），但血浆 Hcy 含量无显著差异（

色谱图,精子,标准品,色谱图

图 1-1 标准品（A）和精子样品（B）中 Hcy 色谱图 1-1 Hcy chromatogram of standard (A) and sperm samples (B图 1-2 高效液相法测定 Hcy 标准曲线Fig 1-2 Hcy standard curve was determined by HPLC Hcy 含量与精液品质关联分析

精子活力,精子,相关分析,猪精子

×109个/次 53.29±29.38 69.74±23.29 0.06有效精子数, ×109个/次 23.27±16.52B61.02±20.66A<0.01精子活力, % 65.02[37.03-76.45]B93.11[92.01-94.00]A<0.01精子畸形率, % 29.12[24.21-36.31]A6 .21[4.05-8.09]B<0.01Hcy 含量 Hcy concentration血浆 Hcy, μmol/L 32.04±18.04 35.13±17.69 0.41精子 Hcy, ×10-9μmol/L 0.17[0.14-0.27]a0.14[0.11-0.18]b<0.05注：1精液品质差为公猪精子活力 < 70%或畸形率 > 20%；2精液品质优为公猪精子活力 > 80%且畸形率 < 10%；3显著水平为 P < 0.05，极显著水平为 P < 0.01。Poor semen quality is motility<70% or abnormal rate>20%; excellent semen quality is motility>80%and abnormal rate<10%; Significant level, P<0.05; marked significant level, P<0.01.如图 1-3 所示，对试验公猪精子 Hcy 含量与精液品质参数进行回归分析发现，精子 Hcy 含量与精子活力呈负相关（Y=-91.48X+98.546; r=0.545，P<0.01），但与精子畸形率相关性不显著（Y=9.4838X+11.836; r=0.098，P=0.50）。

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