疟原虫TatD-like DNase的功能分析及其免疫原性研究
发布时间：2020-08-03 19:48
【摘要】：疟原虫是一种寄生在红细胞内的胞内寄生虫,其生长繁殖主要都在红细胞内完成。由于红细胞内缺少维持正常生命活动所需要的细胞器,所以在受到氧化压力时,寄生在红细胞内的疟原虫DNA更容易受到氧化损伤,受到损伤的疟原虫是怎样进行自我修复的,其修复机制又是什么?这对疟原虫的相关免疫逃避机制、以及新型药物与疫苗的研制具有重要的意义。在本实验中,我们通过生物信息学分析筛选得到了疟原虫Tat D-like DNase蛋白质,该蛋白质具有保守的Tat D DNase结构域,是具有金属离子依赖性的脱氧核糖核酸酶,其蛋白质的结构与生物学特性同大肠杆菌Tat D蛋白质类似,且大肠杆菌Tat D蛋白质已经被证实参与到大肠杆菌DNA的氧化损伤修复过程当中。所以本课题试图揭示,在疟原虫中Tat D-like DNase是否具有与大肠杆菌的Tat D类似的修复DNA损伤的功能,并以此为基础对其作为疫苗候选抗原的免疫原性进行相关研究。首先,我们利用PCR技术对不同流行地区的恶性疟原虫Tat D-like DNase基因进行扩增对其保守性进行分析。结果显示,各流行地区的恶性疟原虫野生株编码Tat D-like DNase的m RNA序列完全相同;差异均发生在内含子区且仅存在5%的差异。由此可知,恶性疟原虫Tat D-like DNase基因在各流行地区都十分保守,这为以该蛋白质作为药物候选靶标与疫苗候选抗原奠定了基础。其次,利用间接免疫荧光试验(IFA)对Tat D-like DNase在虫体内的分布情况进行定位。结果显示,在恶性疟原虫配子体时期、伯氏疟原虫有性与无性阶段该蛋白质均有表达,且分布为于虫体的细胞膜附近。Tat D-like DNase蛋白质在疟原虫各个发育阶段均有表达的特性,为Tat D-like DNase作为疟原虫传播阻断疫苗的候选抗原提供了理论依据。最后,我们通过单细胞凝胶电泳试验与蛋白质迁移试验,证明了该蛋白质在氧化压力存在的情况下,基因的转录水平上调,蛋白质迁移到细胞核位置参与到修复DNA损伤的过程。通过对伯氏疟原虫野生株与Tat D-like DNase敲除株进行比较研究发现,Tat D-like DNase缺陷株的虫体毒力、感染能力与致死性显著下降,并且在虫体受到氧化压力时Tat D-like DNase缺陷株DNA损伤情况较野生株严重。由此证明了在疟原虫中,Tat D-like DNase参与了DNA氧化后损伤修复的过程。在免疫保护性方面,我们证明了Tat D-like DNase抗体可以有效地抑制伯氏疟原虫在小鼠体内的生长发育及配子体的出丝率;有效降低合子在蚊体内的形成数量;我们采用不同佐剂与Tat D-like DNase蛋白质混合免疫小鼠,发现Montanide ISA51佐剂具有良好的保护效果与免疫原性。以上结果显示,疟原虫Tat D-like DNase蛋白质具有修复虫体DNA损伤的功能,且能有效地抑制虫体有性时期与无性时期的发育,该蛋白质具有作为疟疾红内期疫苗与传播阻断疫苗候选抗原的潜质。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.72
【图文】：
图 1.1 PfTatD-like DNase 的结构域分析Figure 1.1 Structure analysis of PfTatD-like DNas结构分析，由图 1.2 可以看出，PfTatD-like DNaaa（1-23 aa）的信号肽结构，根据信号肽假说我们质网加工分泌途径进行加工，并在转运过程中穿过。然后我们通过 swiss model 对该蛋白进行建模，行预测。由图 1.3 可以看出该蛋白质由 6 个 α 螺旋包裹在其内部。由于其末端 α 螺旋为发挥脱氧核糖被包裹在其结构内部，并利用其活性中心对其进行
图 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型构建ure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model constru图中蓝色片段为 α 螺旋，绿色片段为 β 折叠rts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in 分析 软件，将PfTatD-likeDNase 与不同种属疟原虫 进化树。如图 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7原虫的TatDDNase亲缘关系较近；与DNaseI远。
图 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型构建Figure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model construction图中蓝色片段为 α 螺旋，绿色片段为 β 折叠In figure the green parts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in the secondary structure1.3.2 生物进化树分析利用 Mega6.0 软件，将PfTatD-likeDNase 与不同种属疟原虫的DNase 共同构建minimum-evolution 进化树。如图 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7_0112000）（红色方框）与其他种属疟原虫的TatDDNase亲缘关系较近；与DNaseI 和DNaseIII 在进化关系上亲缘关系较远。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.72
【图文】：
图 1.1 PfTatD-like DNase 的结构域分析Figure 1.1 Structure analysis of PfTatD-like DNas结构分析，由图 1.2 可以看出，PfTatD-like DNaaa（1-23 aa）的信号肽结构，根据信号肽假说我们质网加工分泌途径进行加工，并在转运过程中穿过。然后我们通过 swiss model 对该蛋白进行建模，行预测。由图 1.3 可以看出该蛋白质由 6 个 α 螺旋包裹在其内部。由于其末端 α 螺旋为发挥脱氧核糖被包裹在其结构内部，并利用其活性中心对其进行
图 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型构建ure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model constru图中蓝色片段为 α 螺旋，绿色片段为 β 折叠rts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in 分析 软件，将PfTatD-likeDNase 与不同种属疟原虫 进化树。如图 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7原虫的TatDDNase亲缘关系较近；与DNaseI远。
图 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型构建Figure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model construction图中蓝色片段为 α 螺旋，绿色片段为 β 折叠In figure the green parts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in the secondary structure1.3.2 生物进化树分析利用 Mega6.0 软件，将PfTatD-likeDNase 与不同种属疟原虫的DNase 共同构建minimum-evolution 进化树。如图 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7_0112000）（红色方框）与其他种属疟原虫的TatDDNase亲缘关系较近；与DNaseI 和DNaseIII 在进化关系上亲缘关系较远。
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本文编号：2780108
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