宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究

发布时间：2020-08-05 22:17

【摘要】：布鲁氏菌(Brucella)可在吞噬细胞和非吞噬细胞内寄生,引起在我国流行较为广泛的传染性人兽共患布鲁氏菌病(Brucellosis)。近年来,随着畜牧业的快速发展,种群数量和饲养密度逐年增加,导致动物间布鲁氏菌病的感染率和发病率骤然上升。该病感染初期不易被察觉,一旦进入慢性期可导致多种器官和系统受损。动物布鲁氏菌病主要引起公畜睾丸炎、母畜流产、死胎等生殖系统疾病;布鲁氏菌病患者发病主要表现为男性睾丸炎、前列腺炎、女性卵巢炎等。布鲁氏菌病的流行严重威胁养殖业的发展和人类健康,同时造成巨大的经济损失。过氧化物还原酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)是半胱氨酸依赖性过氧化物酶家族的一员,具有三种酶活性,包括过氧化物酶活性、磷脂酶A2活性以及溶血磷脂胆碱脂酰转移酶活性。本课题组前期研究发现,布鲁氏菌感染绵羊后,引起绵羊Prdx6的表达水平发生明显的差异变化。为了深入探讨Prdx6与布鲁氏菌胞内寄生的关系,本课题组成功表达羊和小鼠Prdx6重组蛋白,并制备抗Prdx6兔源多抗和鼠源单抗。经研究发现,宿主Prdx6对巨噬细胞内布鲁氏菌的寄生起促进作用,其表达量的变化与炎症反应、白细胞迁移明显相关。目前未见在其它细胞中研究布鲁氏菌感染与宿主Prdx6关系的研究报道。基于巨噬细胞中Prdx6与布鲁氏菌寄生的重要联系,结合布鲁氏菌感染主要侵袭生殖系统,本研究以HPT-8(小鼠胚胎滋养层细胞)、TM4(小鼠睾丸支持细胞)和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)等生殖系统相关细胞为研究对象,利用过表达、沉默和基因敲除等技术手段,进一步探讨宿主Prdx6与生殖系统相关细胞中布鲁氏菌胞内寄生能力的关系,并分析Prdx6表达量变化引起布鲁氏菌感染生殖系统相关细胞内细胞因子差异表达情况,为进一步探讨布鲁氏菌引发宿主生殖系统疾病的分子机制提供科学依据。本研究利用猪种布鲁氏菌S2菌株感染生殖系统相关细胞,通过Western Blot技术分析胞内Prdx6蛋白表达的变化情况。结果显示:在HPT-8、TM4和CHO三种细胞中,在12 h-48 h Prdx6的表达量均呈显著上升趋势。表明布鲁氏菌感染可以引起生殖系统相关细胞Prdx6的差异表达。通过RNA干扰载体和过表达载体调节HPT-8、TM4和CHO细胞中Prdx6表达水平,分析Prdx6的差异表达对布鲁氏菌在生殖系统相关细胞内存活的影响。同时,利用CRISPR/Cas9技术敲除HPT-8、TM4和CHO细胞系Prdx6基因,以非脂质体转染法将构建的Prdx6-pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA载体转入细胞,经筛选验证,成功建立Prdx6基因缺失的HPT-8细胞系,并利用猪种布鲁氏菌S2菌株侵染Prdx6基因缺失的HPT-8细胞。结果显示,Prdx6的过表达可以提高布鲁氏菌在HPT-8、TM4和CHO等生殖系统相关细胞内的寄生能力。Prdx6的敲降和缺失可减弱布鲁氏菌胞内的生存能力。在对HPT-8、TM4和CHO中的Prdx6进行过表达和干扰后,进行细菌侵染实验,利用荧光定量PCR技术检测相关细胞因子DLL4、ICAM-1、JAM-A、MCSF、MIP-1b和Progranulin的表达。结果显示:在布鲁氏菌侵染条件下,当Prdx6上调表达时,Progranulin呈现下调表达趋势,MCSF呈现上调表达趋势;在Prdx6敲降组细胞中则相反。而DLL4、ICAM-1、JAM-A和MIP-1b无明显差异。Progranulin和MCSF可能与宿主Prdx6响应布鲁氏菌感染相关,但仍需进一步研究。本研究发现宿主Prdx6的表达有利于生殖系统相关细胞内布鲁氏菌的寄生。且在布鲁氏菌感染下,Prdx6的差异表达会引起Progranulin和MCSF细胞因子表达的变化,为深入探究布鲁氏菌在生殖系统相关细胞中感染与寄生机制提供新的切入点,为布鲁氏菌病防控治疗的进一步研究提供依据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

布鲁氏菌病,巨噬细胞,布氏,布鲁氏菌

第一篇文献综述第一章布鲁氏菌的研究进展质网（Endoplasmic Reticulum，ER）运输，为布鲁氏菌在 E前提条件。在 T4SS 系统作用下布氏小体持续与 ER 相互作ar1 和 Rab2 的参与下[40]，布氏小体与过渡性 ER 之间相互融 LAMP-1 逐渐消失，通过膜交换获得 ER 特异性分子如钙连、sec61β、PDI 等，布氏小体将布鲁氏菌送达 ER，并最终转布氏小体（rBCV）。ER 跨膜蛋白 IRE1a 参与布鲁氏菌的复制诱导细胞自噬的发生[41]。当布鲁氏菌到达复制位点后，就开营养物质进行复制，直至细菌量达到一定程度终止复制。当数量后发生自噬，这种自噬对布鲁氏菌的胞内扩散至关重要

自噬,细胞存活,细胞死亡,布鲁氏菌

图 2 自噬途径及其在细胞存活和细胞死亡中的作用2 The autophagy pathway and its roles in cell survival and cel道显示布鲁氏菌在宿主细胞中的存活机制与细胞自噬有主的免疫机制，且非专业吞噬细胞杀灭外来病原菌进行手段也是自噬[48]。布鲁氏菌 VirB 编码的调控蛋白可以应分子的分泌，发现 VirB 缺失株侵染细胞时，宿主的自细菌的繁殖力也下降[49]。明布鲁氏菌所诱导的自噬与经典的自噬过程不同，它不参与，例如 Atg5、Atg16L、Atg4B、Atg7 等，并且发现需要 ULK、Beclin 等蛋白的激活[33]。目前布鲁氏菌与自清楚。氏菌感染非生殖系统相关细胞的研究

机制,活性氧化物,水解甘油,酶活性

图 3 Prdx6 过氧化物酶活性的机制Fig.3 Mechanism for Prdx6 peroxidase activityx6 磷脂酶 A2 活性氧化物酶活性外，哺乳动物 Prdx6 还显示出 Ca2+非依赖性磷活性[151]。在酸性条件下（pH=4），重组 Prdx6 以及从肺中 PLA2 活性最大[152]。研究表明，向反应杯中添加细胞质因子 PLA2 酶活性的 pH 范围[4]。它能够水解甘油磷脂的 sn-2 酰基和溶血磷脂胆碱（LPC），并参与过氧化细胞膜的修复[153性参与肺表面活性剂磷脂的转换，其在磷脂重塑中可以产生二DPPC）[154]。化物酶和 PLA2 活性的活性位点在空间上和功能上都是独立基于丝氨酸的脂肪酶的 PLA2 活性催化三联体结构是 Ser-H

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