狂犬病病毒感染细胞和小鼠的lncRNA和mRNA表达谱变化

发布时间：2020-08-07 05:29

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的传染性疾病。狂犬病是人畜共患病,病死率极高,一旦出现临床症状,死亡率高达100%。据世界卫生组织统计,全球范围内每年有超过5万人死于狂犬病,但绝大多数病例发生在亚洲和非洲等发展中国家。狂犬病病毒可以感染几乎所有的温血动物,野生动物是其主要的储存宿主,人和各种哺乳动物为传播宿主。带毒动物唾液中具有感染性的病毒粒子经抓咬挠伤造成宿主皮肤或粘膜受损随后侵入机体,对CNS侵染随后发病死亡。长链非编码RNA(Long-chain noncoding RNA,lncRNA)是一种长度大于200 nt,缺乏阅读框且不编码蛋白质的RNA分子,它在细胞核和细胞质中均有分布。lncRNA虽然不编码蛋白质,但却参与DNA甲基化、转录激活调控并干扰、细胞核内运输翻译等重要调控过程。lncRNA可通过转录和转录后水平调控基因表达的调控以及对基因进行表观遗传学修饰。机体抗RABV感染主要依靠固有免疫,尤其是I型干扰素反应。病毒感染后,体内细胞表面受体和胞内受体可识别相关模式分子,激活信号通路并诱导细胞分泌I型干扰素。越来越多的证据表明,lncRNA在宿主抗病毒反应、固有免疫中起重要的调节作用。然而,对RABV诱导宿主免疫应答中的lncRNA的表达谱和功能尚不清楚。因此阐述RABV感染诱导的lncRNA表达谱变化对深入探索RABV的致病机制及其防治策略具有重要意义。本实验在细胞水平和小鼠脑组织水平上通过小RNA测序分析RABV感染中lncRNA和mRNA表达谱。首先利用SRV9和CVS11两种病毒分别感染BHK21细胞,感染12 h,24 h,48 h后提取总RNA,构建文库,测序分析lncRNA和mRNA的表达谱。结果显示,与未感染组相比感染CVS11组有940个lncRNA出现差异表达,而感染SRV9组有946个lncRNA出现差异表达。在感染BHK21细胞的mRNA表达谱中,与未感染组相比感染SRV9病毒组有5984个mRNA出现差异表达,感染CVS11病毒组有5674个mRNA出现差异表达(P0.05)。GO富集分析显示,在CVS11组感染48 h后,观察到lncRNA的靶基因对细胞应答、髓样树突细胞活化、巨噬细胞因子产生的调节和趋化因子受体活性的正调节显著富集,而在SRV9组感染48 h后,lncRNA的靶基因对信号转导,蛋白激酶和胚胎形态发生的调节显著富集。KEGG富集分析结果显示CVS11组感染48 h后,lncRNA靶基因有16个KEGG通路显著富集,其中包括涉及免疫应答的途径、病毒致癌作用、FoxO信号通路和MAPK信号通路等;在SRV9感染组中也观察到类似的结果。这些发现表明lncRNA在RABV感染期间调节免疫反应,通过调节其邻近的蛋白质编码基因来对病毒感染作出反应。本研究选取了差异表达lncRNA和mRNA进行了RT-qPCR验证。其次利用CVS11狂犬毒株感染小鼠脑组织,在感染第八天发病时取小鼠脑组织,提取总RNA,构建文库,测序分析lncRNA和mRNA的表达谱。结果表明,与未感染组相比CVS11感染组共有140个lncRNA差异表达。染色体7号,12号和16号的lncRNA差异变化最大;染色体18号,19号和染色体X的lncRNA差异变化最小。同时我们检测了CVS11毒株感染小鼠脑组织后mRNA的表达谱变化,结果表明,与未感染小鼠相比CVS11感染组有3807个lncRNA差异表达基因(FC≥2,P0.05)。染色体2号,7号和11号mRNA差异表达最显著,染色体16号和18号mRNA差异较为显著。GO分析表明lncRNA上游或下游100 kb的位置同位基因编码蛋白高度富集。差异表达的lncRNA共定位的基因高度富集在如氮化合物的解毒、氮化合物的细胞解毒和硝基苯的代谢过程等生物过程中。KEGG分析结果显示,差异表达的lncRNA靶点参与Toll样受体、NF-κB、MAPK、趋化因子、单纯疱疹和流感A感染等重要信号通路。这些发现表明lncRNA在RABV感染期间参与调节免疫反应。随后进行实时定量PCR验证差异表达,结果显示与小RNA测序分析RABV感染后差异表达一致。本研究通过RABV感染细胞和小鼠,分别在体外和体内水平分析lncRNA和mRNA表达谱变化,并选择差异表达lncRNA和mRNA进行RT-qPCR验证。基于生物学信息分析,在体外和体内水平初步明确RABV感染诱导宿主的免疫应答路径。目前,尚未见RABV感染宿主lncRNA表达谱变化的研究。本研究为阐述RABV的免疫逃逸机制和致病机理提供数据支持。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

示意图,狂犬病病毒,粒子结构,示意图

东北农业大学农学硕士学位论文概述V 病原学特征于弹状病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病毒属(lyssavirus)的单股复 75~80 nm，长 175~200 nm，会随不同毒株发生变化[5, 6]。病毒形形，另一端平坦或略凹的典型特征。内层为核壳，内部为核心，状凸起，凸起物远端为槌状。螺旋对称的核衣壳由单股 RNA 和整个病毒表面呈蜂窝状的六角形结构[8]。RABV 可以在多种细胞动物模型例如鼠脑内接种来获取高浓度的病毒，RABV 能耐受低6oC 时 15~30 min 或 100oC 时 2 min 即可灭活。强酸碱、紫外线波均可杀灭病毒，0.01% 碘液和 1%~2% 的肥皂水等亦能使病毒下可长期保存。对常规有机溶剂敏感，一般抗生素对狂犬病病毒

示意图,狂犬病病毒,结构蛋白,示意图

图 1-2 狂犬病病毒结构蛋白示意图[15]Figure 1-2 Schematic representation of rabies virus structural protein[15]RABV 与宿主免疫应答毒侵入机体后，首先会诱导机体产生抗病毒作用的免疫应答过程，包括先天性免疫免疫反应。先天性免疫首先帮助宿主抵抗病毒感染，它包括干扰素(interferon, IFN)胞吞噬功能的增强、炎症反应的产生等。经感染后，IFN 介导的信号通路和细胞转所参与的基因上调，例如干扰素信号通路基因和干扰素调节因子等[16]。随着先天性表达的提高，病毒可引起炎性细胞在中枢神经系统浸润可并造成强烈炎症反应。随毒致病性的免疫反应，但随着神经细胞的损坏，同时也会伴随着一些病理变化的出现RABV 的 N 蛋白的超抗原作用能激活 T 淋巴细胞并刺激机体对无关抗原产生免疫反应够加重炎症反应，还能诱导自身免疫脑脊髓炎的产生[17, 18]。因此，在产生过度免疫况下，经免疫反应介导而导致严重损伤 CNS 组织，引起免疫反应导致机体死亡[1, 19lncRNA 概述 lncRNA 生物学特征及分类

基因,外显子,转录本,基因表达

mRNA）；纵坐标表达水平。ncRNA, mRNA); ordinate expression level.图 3-9 FPKM 法分析 ncRNA 基因和 mRNA 基因表达水alysis of lncRNA gene and mRNA expression level by AF蛋白质的 RNA 相比，lncRNA 在转录本长度和 ORFs 中A 和 lncRNA 之间的外显子数目的显着差异，大多数数 mRNA 含有多达 20 个外显子。大多数 mRNA 的 ORB C

【参考文献】