奶牛Bta-miR-124a靶基因鉴定及功能验证的研究

发布时间：2020-08-07 04:15

【摘要】：microRNA(缩写为miRNA)是长度约为22个核苷酸的单链小分子RNA,能够与mRNA的非编码区结合位点互补结合,从而抑制靶基因的表达。研究表明miR-124能够调控多种基因的表达,具有细胞分化、细胞增殖等作用,并参与绵羊脂肪形成与沉积、猪脂肪细胞分化等生物学过程。脂的合成和代谢是重要的生理过程,但在奶牛中miR-124调控乳脂代谢过程的研究还很有限。因此,本研究旨在对bta-miR-124a(奶牛miR-124a)与乳脂代谢相关的靶基因进行鉴定,并验证其生物学功能。为深入研究miR-124调控脂代谢的分子机制提供依据,从而为具有优质乳品质性状奶牛新品系的分子育种研究提供重要的试验支撑。前期课题组通过高通量测序得到高脂及低脂奶牛乳腺上皮细胞miRNA表达谱,从差异极显著表达的miRNA中,选择bta-miR-124a作为研究对象,并利用奶牛乳腺上皮细胞为试验材料,对bta-miR-124a靶基因及其生物学功能进行验证。首先,采用生物信息学方法分析bta-miR-124a成熟区序列保守性,并对其候选靶基因进行预测,同时对bta-miR-124a候选靶基因信号通路进行深入分析。结果表明,bta-miR-124a的成熟序列在各物种间具有高度的保守性,预测得到TargetScan和miRWalk数据库交集候选靶基因57个,其候选靶基因能够参与癌症发生、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶,mitogen-activated protein kinase)、AMPK(单磷酸腺苷活化蛋白激酶,AMP-activated protein)、cAMP(环磷酸腺苷,Cyclic adenosine monophosphate)信号转导、脂代谢及脂肪酸合成等多种重要的细胞调控通路。其中,与脂代谢相关的候选靶基因有PECR(过氧化物酶体反式-2-烯酰辅酶A还原酶,peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase)、SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶,stearoyl-CoA desaturase)、ELOVL5(脂肪酸延长酶5,fatty acid elongase 5)、CPT1A(肉碱棕榈酰转移酶1A,carnitine palmitoyl transferase 1A)等。本研究选择PECR基因做进一步靶基因鉴定及功能验证,方法主要采用的是双荧光素酶报告基因和实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究了进一步鉴定bta-miR-124a与靶基因的靶向关系。结果表明:过表达bta-miR-124a组细胞中PECR基因表达量和蛋白表达显著低于对照组(p0.05),抑制bta-miR-124a组细胞中PECR基因表达量和蛋白表达显著高于对照组(p0.05)。此外,转染bta-miR-124a mimics、bta-miR-124a inhibitor组后PECR下游基因ELOVL2(脂肪酸延长酶2,fatty acid elongase 2)表达量、细胞中总甘油三酯和游离脂肪酸含量也做了进一步的检测。结果显示:转染bta-miR-124a过表达组中,bta-miR-124a能够显著正调控PECR下游基因ELOVL2(p0.05)的表达量以及甘油三酯(p0.01)和游离脂肪酸(p0.05)的含量。与对照组相比,转染bta-miR-124a抑制剂后bta-miR-124a能够显著负调控ELOVL2的表达量(p0.01)。而甘油三酯的表达量高于对照组以及游离脂肪酸含量低于对照组,均未见显著性差异。以上结果得出结论:(1)bta-miR-124与PECR基因通过生物信息学分析、荧光定量PCR及双荧光素酶验证得到具有靶向关系,PECR为bta-miR-124a的靶基因。(2)bta-miR-124a能够在脂代谢通路中,调控PECR下游基因ELOVL2的表达量。(3)bta-miR-124a能有效地影响奶牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯和游离脂肪酸含量,从而参与调控乳汁的合成和分泌。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823
【图文】：

基因相互作用,蛋白质

图 1-2 PECR 基因相互作用的蛋白质Fig1-2 Interacting Proteins for PECR gene（选自 https://www.genecards.org/）

靶基因,软件

图 2-1 两种软件对 miR-124a 的候选靶基因预测get Gene prediction results of bta-miR-124a using two kinds 靶基因 GO 分析

功能注释,靶基因,分子

图 2-2 bta-miR-124a 候选靶基因的 GO 分子功能注释分析Fig2-2 The GO molecular functional annotation of bta-miR-124apredicted candidate target genes

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