捻转血矛线虫透明质酸酶鉴定及其功能的初步研究
发布时间：2020-08-07 03:15
【摘要】：捻转血矛线虫会引起严重的牛羊寄生虫病,寄生于宿主真胃,造成幼畜死亡,带来严重的经济损失。目前捻转血矛线虫病的防控仍然是以药物预防为主,但线虫耐药问题的日益严重,迫切需要探索新的防控措施和干预靶点。捻转血矛线虫经历自由生活阶段和寄生阶段,感染期幼虫为三期幼虫(L3),当L3幼虫经口感染宿主后,约3天到达皱胃,然后钻入皱胃黏膜下发育至四期幼虫(L4)后再钻出黏膜定植于皱胃表面发育至成虫。钻入胃黏膜下方是捻转血矛线虫入侵过程中的重要环节。透明质酸酶(HAase)能够降解胞外黏多糖透明质酸,钩虫相关的研究表明在入侵过程中发挥了作用,而且体外培养捻转血矛线虫时,在L3幼虫发育至L4幼虫的早期过程中,能够向体外释放透明质酸酶水解透明质酸。本实验室前期的研究工作表明,辐照后捻转血矛线虫的成虫发育率降低,且下调透明质酸酶基因的表达。因此我们推测,透明质酸酶的表达量与捻转血矛线虫的毒力存在联系。基于此我们开展了捻转血矛线虫透明质酸酶功能的初步研究工作。首先根据公布在GenBank上的捻转血矛线虫透明质酸酶的全基因序列,分析表明透明质酸酶基因编码511个氨基酸,理论分子量为57kD,利用signalP预测显示存在信号肽。PCR扩增目的基因序列,经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌中进行原核表达并通过Western blot分析其免疫原性;通过免疫组化的方法鉴定透明质酸酶在捻转血矛线虫L3幼虫中的分布情况;最后用RNA干扰技术,针对透明质酸酶基因设计并合成特异性siRNA,通过电转方式将siRNA导入捻转血矛线虫感染性L3幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析透明质酸酶基因在L3幼虫中的转录抑制效果;将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊皱胃外植体,检测透明质酸酶基因沉默后虫体对皱胃组织的侵入率,并且对L3幼虫入侵后的皱胃外植体进行组织切片观察;同时将透明质酸酶特异性siRNA电转导入L3幼虫24h后感染绵羊,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,第35d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数以及成虫形态及体表损伤。初步结果表明:western-bolt结果表明重组HC-HAase有良好的免疫原性,而且免疫组化结果显示HAase在虫体中主要分布于头部,为证明该酶在入侵时发挥重要作用提供有效依据;电转24h后实时荧光定量PCR检测捻转血矛线虫L3幼虫透明质酸酶基因的表达量,试验组中透明质酸酶基因的相对表达量显著低于对照组(p0.05),通过电转法将透明质酸酶基因特异性siRNA导入脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫后能有效降低透明质酸酶的酶活性单位。体外实验结果表明将透明质酸酶基因干扰后捻转血矛线虫L3幼虫对胃组织外植体的入侵率为9.45%,而对照组为53.62%。动物体内实验结果表明脱鞘捻转血矛线虫L3幼虫经过siRNA干扰后感染绵羊18-32天检测粪便中虫卵数量,干扰组绵羊的每克粪便虫卵数明显低于对照组;35天后剖检皱胃内成虫数,对照组虫体定植率为77.1%,实验组为39.7%,且两组存在显著差异(P0.01);捻转血矛线虫L3幼虫可能通过分泌透明质酸酶分解宿主黏膜组织,有利于虫体侵入宿主黏膜,进而促进虫体在宿主黏膜中的定植。透明质酸酶作为捻转血矛线虫入侵时的关键毒力因子,其功能性研究,有利于对捻转血矛线虫病的防治。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.731
【图文】：
上海师范皱胃黏膜下发育至 L4 后再钻出黏膜定植，30d 时达到产卵高峰，产卵时间一般维持于皱胃（图 1-1）。捻转血矛线虫以吸食宿主每天可以吸食 30ml 血液，造成宿主贫血，功能，使宿主贫血进一步恶化，最终造成死亡率最高,成年羊抵抗力较强,被感染羊有感染的情况。低湿的草地有利于本病的传播的发病多在一月份，尤以一月份和三月多有发病。虫卵最适孵化温度为 20~30℃，虫4℃停止发育，1℃以下低温或 60℃以上高自由生活，抵抗力较弱，第 3 期幼虫因带鞘
图 1-2 RNAi 的发生机制Fig1-2 RNAi Mechanism筛选及合成基因水平上，必须需要一个有效的选择过程来有高潜力的 siRNA 寡核苷酸。许多相互关联体外的生物学活性[76]。就 RNA 靶位本身而言，点和蛋白质的结合程度。核苷酸序列不仅影响通过非碱基配对相互结合作用与其他序列相关条 siRNA 寡聚核苷酸链作为高效抑制子的前双链的形成。目前，设计 siRNA 寡聚核苷酸域，如 5，和 3，非翻译区域（UTR），75bp 的起小于 30%的序列。虽然已有的 siRNA 筛选规保证每一筛选的 siRNA 都起作用[77]。已知有
A B图 2-1 荧光显微镜下观察 siRNA 导入虫体情况Fig.2-1 Observation of siRNA introduction into worms under fluorescence microscope（A 白光下拍摄；B 荧光下拍摄）2.3.2 Q-PCR 检测基因的表达抑制情况siRNA 干扰后收集实验组和对照组的捻转血矛线虫进行 mRNA 抽提，反转录成 cDNA，用 Q-PCR 检测 HAase 基因的表达情况，结果如图 2-2 所示，电转化 HC-HAase 基因特异性 siRNA 后能显著降低 HC-HAase 基因的表达量，且抑制效果显著（P＜0.05）。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.731
【图文】：
上海师范皱胃黏膜下发育至 L4 后再钻出黏膜定植，30d 时达到产卵高峰，产卵时间一般维持于皱胃（图 1-1）。捻转血矛线虫以吸食宿主每天可以吸食 30ml 血液，造成宿主贫血，功能，使宿主贫血进一步恶化，最终造成死亡率最高,成年羊抵抗力较强,被感染羊有感染的情况。低湿的草地有利于本病的传播的发病多在一月份，尤以一月份和三月多有发病。虫卵最适孵化温度为 20~30℃，虫4℃停止发育，1℃以下低温或 60℃以上高自由生活，抵抗力较弱，第 3 期幼虫因带鞘
图 1-2 RNAi 的发生机制Fig1-2 RNAi Mechanism筛选及合成基因水平上，必须需要一个有效的选择过程来有高潜力的 siRNA 寡核苷酸。许多相互关联体外的生物学活性[76]。就 RNA 靶位本身而言，点和蛋白质的结合程度。核苷酸序列不仅影响通过非碱基配对相互结合作用与其他序列相关条 siRNA 寡聚核苷酸链作为高效抑制子的前双链的形成。目前，设计 siRNA 寡聚核苷酸域，如 5，和 3，非翻译区域（UTR），75bp 的起小于 30%的序列。虽然已有的 siRNA 筛选规保证每一筛选的 siRNA 都起作用[77]。已知有
A B图 2-1 荧光显微镜下观察 siRNA 导入虫体情况Fig.2-1 Observation of siRNA introduction into worms under fluorescence microscope（A 白光下拍摄；B 荧光下拍摄）2.3.2 Q-PCR 检测基因的表达抑制情况siRNA 干扰后收集实验组和对照组的捻转血矛线虫进行 mRNA 抽提，反转录成 cDNA，用 Q-PCR 检测 HAase 基因的表达情况，结果如图 2-2 所示，电转化 HC-HAase 基因特异性 siRNA 后能显著降低 HC-HAase 基因的表达量，且抑制效果显著（P＜0.05）。
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本文编号：2783390
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