牛副流感病毒3型NP蛋白单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA建立
发布时间：2020-08-07 13:59
【摘要】：牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的主要病毒性病原有牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),每年给全球的养牛业造成了巨大的经济损失。其中BPIV3是主要的病毒性病原,为副黏病毒科(Paramyxoviridae)呼吸道病毒属(Respirovirus)成员。BPIV3为单股负链RNA病毒,通常被称为“运输热”病毒。BPIV3分为三个基因型,分别为A型、B型和C型。BPIV3主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎和被感染肺叶的实变。临床上主要表现为发热、流泪、流鼻涕和呼吸加快等症状。该病毒自从1959年在美国首次分离报道以来,现在全世界流行。朱远茂等(2011)在我国山东省首次分离到新基因C型的BPIV3。目前虽然我国对BPIV3有了一些研究,但国内目前还没有商品化的疫苗及检测试剂。本研究利用BPIV3的全病毒免疫6~8周龄雌性Balb/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)进行融合。采用以核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA进行阳性杂交瘤细胞的筛选,通过3次克隆筛选获得7株稳定分泌BPIV3 NP单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞株2G7、6F8、6H8、7G5、7G8、7G9、7H5。这些杂交瘤细胞制备的腹水效价均在1×105到1×107。经间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测表明其具有良好的反应性和特异性。抗体亚类鉴定结果均为Ig G1/κ。选取效价高的6F8、7G5、7G8、7G9、7H5等5株单抗,利用原核表达一系列重叠的NP重组蛋白对NP蛋白进行表位鉴定,结果表明:单抗6F8识别的表位为428ESRGDQDQ435,单抗7G5、7G8、7G9、7H5识别的表位为407FYKPTGG413。同时以3%的明胶加5%的脱脂乳为封闭液,6F8为包被抗体,HRP标记的7G9为检测抗体建立了双抗夹心ELISA,用于检测病原BPIV3。以30份已确定的BPIV3阴性样品的ELISA OD值为参照,确定了cut-off值为0.252。当OD450值大于0.252时,判定检测样品为阳性;等于或低于该值判定为阴性。特异性试验结果表明,该ELISA只与BPIV3反应,不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛腺病毒3型反应。敏感性试验表明该方法检测病毒的最低限度为103.36 TCID50/0.1ml。经现有的34份阳性牛鼻拭子和阳性牛肺脏经RT-PCR验证,该方法与RT-PCR的符合率为97%。综上所述,本研究成功制备了7株针对NP蛋白的单克隆抗体,并对其中的效价高的5株单克隆抗体进行了表位鉴定,并鉴定出两个抗原表位。用针对上述两个不同抗原表位的单抗6F8和7G9建立了双抗夹心ELISA。特异性和敏感性试验及与RT-PCR的符合率试验表明该双抗夹心ELISA具有较好的表现,可试用于BPIV3的检测。同时,本研究为BPIV3 NP蛋白生物学结构与功能研究及病毒致病性的研究奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：
ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反应。3.1.6 抗原表位的血清学分析为了研究表位是否是 BPIV3 的优势表位，用鉴定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份来自免疫BPIV3 SD0835的牛阳性血清做为一抗，用间接ELISA方法鉴定，ELISA方法同2.1.8，同时设阴性对照。3.2 结果3.2.1 NP 蛋白的截短表达与抗原表位的初步鉴定将截短的 NP 蛋白经单克隆抗体 Western blot 鉴定，单克隆抗体 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而单克隆抗体 6F8 能与多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反应，因此其抗原表位初步定为在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均针对相同的抗原表位。NP 截短方案如图所示：
农业科学院硕士学位论文 第三章 NP 蛋白的抗原表位鉴定.4 单克隆抗体的跨种反应分析根据 BPIV3a、BPIV3b、BPIV3c 和 HPIV3 基因序列按照 3.1.3 方法，分别表达 BPIV3a 的SRGDQDQ435、407FHKPTGG413；BPIV3b 的428DSKGDQDQ435、407FQKPTGG413和 HPIV3 的HRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析，结果显示 mAb 7G5 与 BPIV3aPIV3 有交叉反应；而 mAb 6F8 只能与 BPIV3a 有交叉反应。该结果表明两个表位均属于相守的表位。
ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反应。3.1.6 抗原表位的血清学分析为了研究表位是否是 BPIV3 的优势表位，用鉴定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份来自免疫BPIV3 SD0835的牛阳性血清做为一抗，用间接ELISA方法鉴定，ELISA方法同2.1.8，同时设阴性对照。3.2 结果3.2.1 NP 蛋白的截短表达与抗原表位的初步鉴定将截短的 NP 蛋白经单克隆抗体 Western blot 鉴定，单克隆抗体 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而单克隆抗体 6F8 能与多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反应，因此其抗原表位初步定为在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均针对相同的抗原表位。NP 截短方案如图所示：
本文编号：2784091
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：
ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反应。3.1.6 抗原表位的血清学分析为了研究表位是否是 BPIV3 的优势表位，用鉴定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份来自免疫BPIV3 SD0835的牛阳性血清做为一抗，用间接ELISA方法鉴定，ELISA方法同2.1.8，同时设阴性对照。3.2 结果3.2.1 NP 蛋白的截短表达与抗原表位的初步鉴定将截短的 NP 蛋白经单克隆抗体 Western blot 鉴定，单克隆抗体 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而单克隆抗体 6F8 能与多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反应，因此其抗原表位初步定为在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均针对相同的抗原表位。NP 截短方案如图所示：
农业科学院硕士学位论文 第三章 NP 蛋白的抗原表位鉴定.4 单克隆抗体的跨种反应分析根据 BPIV3a、BPIV3b、BPIV3c 和 HPIV3 基因序列按照 3.1.3 方法，分别表达 BPIV3a 的SRGDQDQ435、407FHKPTGG413；BPIV3b 的428DSKGDQDQ435、407FQKPTGG413和 HPIV3 的HRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析，结果显示 mAb 7G5 与 BPIV3aPIV3 有交叉反应；而 mAb 6F8 只能与 BPIV3a 有交叉反应。该结果表明两个表位均属于相守的表位。
ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413这 6 条短肽，用间接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反应。3.1.6 抗原表位的血清学分析为了研究表位是否是 BPIV3 的优势表位，用鉴定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份来自免疫BPIV3 SD0835的牛阳性血清做为一抗，用间接ELISA方法鉴定，ELISA方法同2.1.8，同时设阴性对照。3.2 结果3.2.1 NP 蛋白的截短表达与抗原表位的初步鉴定将截短的 NP 蛋白经单克隆抗体 Western blot 鉴定，单克隆抗体 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而单克隆抗体 6F8 能与多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反应，因此其抗原表位初步定为在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均针对相同的抗原表位。NP 截短方案如图所示：
【参考文献】
相关硕士学位论文 前2条
1 史鸿飞;牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用[D];中国农业科学院;2010年
2 吕闯;牛副流感病毒3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用[D];中国农业科学院;2012年
本文编号：2784091
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