利用蛹虫草菌丝体表达融合抗菌肽及其功能研究

发布时间：2020-08-08 12:22

【摘要】：抗生素对畜禽动物具有促进生长和防治疾病的功效,但是近年来由于抗生素的不合理使用导致抗生素残留以及耐药细菌的不断出现等隐患,并且随着消费者对“无抗”产品需求的增加,因此研发安全、高效的新型饲用抗生素替代产品成为当前我国畜禽业健康养殖的研究热点。抗菌肽作为抗生素的替代品具有广谱抗菌活性、免疫调节活性以及不易产生耐药性等特点,其中,从非洲爪蟾(Xenopus laevis)皮肤中分离到的爪蟾素(Magainin II)以及从天蚕(Bombyx mori)中分离得到的天蚕素B(Cecropin B)是抗菌肽中公认的能够提高细菌性疾病抵抗力的良好候选分子之一。除了天然的抗菌肽之外,许多重组表达的抗菌肽在稳定性和特异性方面更具优势,但目前为止关于利用食药用真菌蛹虫草(Cordyceps militaris)作为抗菌肽的重组表达载体方面的研究未见报道。本研究首先利用蛹虫草菌丝体作为受体系统,将Magainin II-Cecropin B(Mag II-CB)融合抗菌肽基因以及Cecropin B(CB)基因分别转入到蛹虫草菌丝体中进行高效表达;并利用Ni-NTA亲和层析法纯化所获得的重组抗菌肽Mag II-CB和CB,对其体外抑菌活性和抗菌机制进行了初步验证;进一步通过利用感染大肠杆菌ATCC 25922的BALB/c小鼠为模型,分别分析验证了纯化的重组抗菌肽和低温冻干的转抗菌肽基因蛹虫草菌丝的功能活性。结果显示,利用蛹虫草菌丝体表达的重组抗菌肽以及所获得的转抗菌肽基因蛹虫草菌丝都具有高效的抑菌活性和免疫活性。具体研究结果如下:1、蛹虫草原生质体提取最佳条件为:菌龄4 d、酶解温度34℃以及酶解时间4 h,蛹虫草原生质体的提取量平均达到10~7-10~8个/mL。确定蛹虫草原生质体的再生培养基为含0.8 M甘露醇的PDA培养基,潮霉素抗性的最小抑制浓度为650 mg/L。确定根瘤农杆菌转化的最优条件为:诱导剂乙酰丁香酮浓度200μM、共培养时间2 d以及根瘤农杆菌与蛹虫草原生质体的个数比为10~7/10~5。2、构建含杂合抗菌肽Mag II-CB基因的真菌表达载体pCB130-Mag II-CB以及只含CB基因的真菌表达载体pCB130-CB,并利用根瘤农杆菌介导转化法转化蛹虫草原生质体,通过PCR以及Western Blot检测分别获得6株转Mag II-CB基因的蛹虫草菌株和5株转CB基因的蛹虫草菌株,ELISA测定Mag II-CB和CB的产量约占总可溶性蛋白的0.938±0.072‰和0.705±0.054‰。3、利用Ni-NTA亲和层析法纯化含组氨酸标签的重组抗菌肽Mag II-CB和CB,ELISA测定Mag II-CB和CB的纯化率为82.6%和80.4%。通过平板打孔法以及最小抑菌浓度分析测定重组抗菌肽Mag II-CB在抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌方面比重组抗菌肽CB表现出更有效的抑菌活性。此外,观察分析重组抗菌肽对大肠杆菌细胞膜渗透性以及利用扫描电镜观察其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用,结果显示重组抗菌肽Mag II-CB和CB可通过胞外抑菌机制作用于细菌的细胞膜,最终导致菌体死亡,并且重组抗菌肽Mag II-CB显示出更强的抑菌作用。4、在获得纯化的重组抗菌肽基础上,以感染大肠杆菌ATCC 25922的BALB/c小鼠为试验动物模型,确定大肠杆菌ATCC 25922的最小致死剂量以及小鼠体内重组抗菌肽的最小保护浓度分别为1×10~9 CFU/mL和8 mg/kg,进一步分析发现重组抗菌肽能够调节肠道内微生物菌群,改善小鼠肠道绒毛损伤,缓解染菌小鼠的肠道绒毛长度、隐窝深度以及绒毛长度与隐窝深度比值的降低。同时发现重组杂合抗菌肽Mag II-CB能够明显地提高小鼠肠道中紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达水平,降低因腹腔注射大肠杆菌后引起的血浆中IgA、IgM、IgG以及回肠中sIgA水平的增加,此外,能够降低促炎细胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表达水平,增加抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达水平。5、通过给感染大肠杆菌ATCC 25922的BALB/c小鼠饲喂转抗菌肽基因蛹虫草菌丝进一步研究转基因蛹虫草菌丝功能活性,结果显示转基因蛹虫草菌丝能够通过口服的方式来调节肠道微生物菌群的变化,并且有效地改善了小鼠肠粘膜以及肠道绒毛损伤情况,维持了肠道形态的完整性。此外,转Mag II-CB基因蛹虫草菌丝能够提高紧密连接蛋白的表达水平,降低小鼠血浆中IgA、IgM、IgG以及回肠中sIgA的水平,并且降低促炎细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,增加抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达水平,与纯化的重组抗菌肽研究结果相一致。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S816.7
【图文】：

抑菌作用,机制,抑菌机制,细菌细胞

图 1.1 抗菌肽的抑菌作用机制[4]Fig.1.1 Mechanisms of action of antimicrobial peptides1.2.1 抗菌肽的胞外抑菌机制抗菌肽胞外抑菌机制主要分为作用于细菌细胞膜以及非膜性的外部靶点两种方式。

蛹虫草,原生质体,菌龄,酶解时间

符合后续实验要求，因此采用菌龄为 4 d、酶解温度 34 ℃、酶解时间 4 h的最佳条件来制备蛹虫草原生质体。图2.1 菌龄、酶解温度和酶解时间对蛹虫草原生质体提取的影响Fig.2.1 Effects of age, temperature and enzymatic hydrolysis time on protoplast extraction of Cordycepsmilitaris2.2.2 蛹虫草原生质体的制备及其活性检测按照所筛选的最优条件对液体发酵的蛹虫草菌球进行蛹虫草原生质体的制备，显微镜下观察所制备的原生质体状态良好（图 2.2），并进行 FDA 染色检测原生质体的活性，荧光倒置显微镜下原生质体的活性良好（图 2.3），并且经统计，蛹虫草原生质体的数量达到 107-108个/mL，原生质体活性高达 90%以上。

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22图2.2 显微镜下观察蛹虫草原生质体的状态Fig.2.2 Status of C. militaris protoplasts observing under microscope图 2.3 荧光显微镜下观察 FDA 染色后蛹虫草原生质体的状态Fig.2.3 Status of FDA-stained C. militaris protoplasts observing under fluorescence microscope2.2.3 蛹虫草原生质体再生培养基的确定通过在 PDA、MYG 及纤维二糖培养基三种不同的再生培养基上涂布同等数量的原生质体，25 ℃避光培养 7 d 后，对蛹虫草原生质体的再生情况进行观察。如图 2.4 所示，原生质体再生情况最好的是在含 0.8 M 甘露醇的 PDA 培养基上（图 2.4-A），其次为 MYG培养基（图 2.4-B），最差的是在纤维二糖培养基上（图 2.4-C）。

【参考文献】