影响水牛精原细胞富集及体外增殖相关因素的初步研究

发布时间：2020-08-08 13:28

【摘要】：水牛是中国南方重要家畜之一,由于其繁殖效率低下及优秀种质资源缺乏,严重制约了水牛产业的发展。精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs)是动物种质资源改良和新品种培育最具潜力的种子细胞之一,已成为当前动物繁殖学领域研究的热点。目前小鼠SSCs体外培养系统已较成熟,但是水牛相关研究较少,已知的SSCs体外培养系统尚不能满足水牛SSCs体外长期培养需求。本研究拟通过探索影响水牛精原干细胞富集及体外增殖的相关因素,为优化当前水牛SSCs体外培养系统奠定基础。取得的主要研究成果如下:1.探讨了影响水牛支持细胞(sertoli)饲养层细胞制备的相关因素。水牛睾丸细胞悬液经差异贴壁6 h,对已贴壁细胞用sertoli细胞特异性抗体WT1免疫荧光染色并计数,其纯度可达95%以上。以不同浓度丝裂霉素C处理sertoli细胞,结果显示,3.0 μg/mL丝裂霉素C处理组细胞增殖显著低于对照组和1.5μg/ml裂霉素C处理组,但与其它处理组无显著差异,所以制备sertoli饲养层细胞的丝裂霉素C处理浓度以3.0 μg/ml为宜。收集不同代sertoli细胞(0-10代),采用qRT-PCR分析sertoli细胞特异表达基因,结果显示,P6、P7和P8代的sertoli细胞中GDNF表达量显著高于其它代细胞,而P7和P8代的SCF与FGF2表达量显著高于其它代细胞。2.观察了不同年龄水牛SSCs相关基因的表达状况。利用DDX4抗体与PGP9.5抗体对水牛睾丸组织SSCs进行定位,发现SSCs主要分布于曲细精管基底膜附近。采用qRT-PCR分析青春期前和成牛水牛睾丸细胞悬液SSCs相关基因的表达,结果显示青春期前睾丸细胞悬液Nanos2表达量显著高于成年水牛。水牛睾丸细胞悬液经明胶和鼠尾胶原蛋白差异贴壁富集SSCs细胞,结果显示富集后的细胞PGP9.5阳性细胞数量显著高于未差异贴壁组,并且经差异贴壁PGP9.5阳性细胞数量是未差异贴壁细胞的2.3倍。3.探讨了褪黑激素(Melatonin)和CHIR-99021(简称 CHIR)对SSCs体外增殖的影响。在IMDM培养系统中分别添加不同浓度褪黑激素或CHIR,SSCs经培养4天后传代,继续培养4天后,收集细胞,对SSCs干性及生殖相关基因(PLZF,DDX4,NANOS2)、分化相关基因(DMRT1,REC8,DAZL)、氧化相关基因(CAT,SOD3)和细胞增殖相关基因(CCND1,CCNE1)进行qRT-PCR分析,结果显示,与对照组相比,10-6MMelatonin处理组SSCs中PLZF、DDX4、SOD3表达量显著高于对照组;而DMRT1和REC8显著下调;CCND1基因表达在各组中无显著差异。10-6M Melatonin处理组与对照组的DDX4和PGP9.5阳性细胞数无显著差异。添加10 μM CHIR处理组SSCs中PLZF表达量极显著高于其它组,与对照组相比,NANOS2、CCND1、CCNE1表达量显著上调;DAZL、DMRT1、CAT和SOD3均显著下调。10μMCHIR处理组DDX4和PGP9.5阳性细胞数显著高于对照组,10 μM CHIR处理组阳性细胞数增加了1.7倍。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.83
【图文】：

丸曲细精管紧靠基底膜附近，但是在青春期前水牛睾丸中ＷＴ１阳性细胞的密度逡逑远大于成年水牛的密度，这与成年水牛已经进行精子发生有密切联系，其与支持逡逑细胞特性是－致的（图１－２）。逡逑ｗＳＫＳｓｍＳＢｍ逡逑ｉｍｍｍｍＫｍ邋■ＨＨＨＩ邋■ｗＢＩ逡逑图１－２：青春期前与成年水牛睾丸组织免疫组织化学染色；比例尺：２００ｐｍ逡逑Ｆｉｇｌ－２：邋Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔｙ邋ａｎｄ邋ａｄｕｌｔ邋ｂｕｆｆａｌｏ，邋ｓｃａｌｅ逡逑ｂａｒ：邋２００｜．ｕｎ逡逑水牛睾丸细胞悬液经明胶差速贴壁６邋ｈ，对己经贴壁细胞经ｓｅｒｔｏｌｉ细胞特异逡逑性抗体ＷＴ１免疫荧光染色，ｓｅｒｔｏｌｉ细胞纯度达到９５％以上（图１－３）。所以认为逡逑从水牛睾丸细胞悬液经差速贴壁所得到的细胞为ｓｅｒｔｏｌｉ细胞，将为下一步的实验逡逑提供支持。逡逑ＭＢＢｒｎＳ逡逑ＶＳＳＳＢＳ逦ＨＨＩ逡逑图１－３：支持细胞特异性抗体ＷＴ免疫细胞染色；比例尺：２００ｐｍ逡逑２２逡逑

ｍｍ逡逑胰酶消化前曲细精管逦胰＿消化所得水Ｈ丸细胞总：液逡逑图２－２：胰酶消化曲细精管前后；比例尺：２０（Ｈｉｍ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｒｙｐｓｉｎ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓ邋ｔｕｂｕｌｅｓ；邋ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋２００（ｉｍ逡逑通过ＩＨＣ对水牛睾丸内ＳＳＣｓ进行了定位，我们希望对青春期前－成年水牛逡逑睾丸细胞悬液在基因水平上进行分析。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示，ＳＳＣｓ特异性基因逡逑Ｎａｎ0Ｓ２在青春期前的表达量显著高于成年水牛（图２－３邋Ａ）；而生殖系细胞标记逡逑基因ＤＤＸ４在成年水牛睾丸悬液细胞中的表达量远远大于青春期前水牛（图２－３逡逑Ｂ）；干细胞特异性基因Ｏｃｔ４在两种细胞中没有显著差异（图２－３邋Ｃ）。逡逑ＡＢＣ逡逑ＮＡＮＯＳ２逦Ｄ０Ｘ４逦０ＣＴ４逡逑0逦９逡逑｜逦１５逦｜逦１！０１逦＿逦｜逦ｎｓ逡逑ｉ：逦！：Ｆｌｉｌ逡逑１邋Ｊ邋Ｉ，－ｊ逦Ｉ邋Ｊ逦Ｉ邋Ｊ逡逑ａ邋＾邋＾邋，逡逑图２－３：青春期前－成年水牛睾丸组织细胞悬液不同基因ｍＲＮＡ表达量；Ａ．Ｎａｎｏｓ２基因逡逑Ｂ．ＤＤＸ４基因Ｃ．ＯＣＴ４基因逡逑Ｆｉｇ邋２－３：邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｐｒｅ－ｐｕｂｅｒｔａｌ－ａｄｕｌｔ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑ｃｅｌｌ邋ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ；邋Ａ．邋Ｎａｎｏｓ２邋ｇｅｎｅ邋Ｂ．邋ＤＤＸ４邋ｇｅｎｅ邋Ｃ．邋ＯＣＴ４邋ｇｅｎｅ逡逑２．２＿３邋７＞Ｃ牛ＳＳＣｓ的富集逡逑将制备好的睾丸细胞悬液离心

将水牛睾丸细胞悬液与经明胶和鼠尾胶原蛋白差异贴壁收集的漂浮细胞以逡逑相同细胞密度接种到饲养层上，使用精原干细胞特异性抗体ＰＧＰ９．５进行免疫荧逡逑光染色并统计分析（图２－５邋Ａ、Ｂ），结果显示，经差异贴壁精原千细胞含量是未逡逑差异贴壁的２．３倍，显著高于未差异贴壁精原干细胞量（图２－５邋Ｃ）。逡逑３３逡逑

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