APS通过ROS减轻细胞自噬对染镉鸡胚成纤维细胞损伤作用的研究

发布时间：2020-08-08 19:58

【摘要】：镉(Cd)是一种危害极大的重金属污染物,它能造成机体氧化应激,诱导细胞损伤。活性氧(ROS)是机体内含氧并且性质活泼的物质的总称,过量的ROS可造成机体损伤。研究发现,镉中毒会使细胞内产生大量的ROS,并且发生细胞自噬,这提示ROS可能与镉诱导的自噬存在关联。黄芪多糖(APS)是黄芪提取物中具有抗氧化、抗应激等生物学功能的多糖,但目前关于APS对动物镉中毒影响的研究很少。因此,本试验以鸡胚成纤维细胞(CEF)为研究对象,在建立染镉CEF自噬和损伤模型的基础上,研究APS与ROS之间的关系以及APS对镉诱导细胞自噬损伤的影响及机制。首先,为建立Cd诱导CEF自噬和损伤模型,将CdCl_2溶液以不同剂量、不同时间孵育CEF,检测CEF内自噬蛋白LC3的表达及细胞活力变化。结果发现,不同浓度CdCl_2溶液孵育的CEF内LC3均有不同程度的表达,在10μmol/L的浓度、孵育36 h时CEF内LC3表达量最高且细胞发生损伤。之后,为研究APS通过ROS抑制Cd致CEF的损伤作用,将CEF分为对照组、10μmol/L Cd组、自噬抑制剂3-MA+Cd组、3-MA组、自噬激活剂RAPA组、活性氧抑制剂NAC+Cd组、NAC组、40μg/mL APS+Cd组、APS组,通过DCFH-DA染色法检测细胞内ROS含量的变化,生物化学方法检测过氧化物丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性变化,自噬体检测试剂盒检测自噬小体数量变化,Western-blot法检测自噬蛋白LC3、Beclin-1、mTOR表达变化,超微透射电镜技术观察CEF的病理形态变化,CCK-8法检测CEF活力变化。结果发现:(1)Cd组CEF内ROS含量较C组显著升高(P0.05),而NAC+Cd组、APS+Cd组CEF内ROS与Cd组相比显著降低(P0.05);(2)Cd组CEF内MDA含量显著高于C组,SOD和GSH-Px活性显著低于C组(P0.05),而APS+Cd组CEF中MDA含量与Cd组相比显著降低(P0.05),SOD和GSH-Px活性极显著高于Cd组(P0.05);(3)自噬体数量检测显示,RAPA组、Cd组与C组相比自噬体数量显著增加(P0.05),3-MA+Cd组与Cd组相比自噬体数量显著减少(P0.05);(4)Western-blot结果显示,Cd组CEF内LC3与Beclin-1的表达显著高于C组(P0.05),APS+Cd组中LC3与Beclin-1的表达较Cd组明显降低(P0.05);mTOR蛋白表达在Cd组显著低于C组(P0.05),APS+Cd组中mTOR的表达与Cd组相比显著升高(P0.05);3-MA+Cd组与Cd组相比LC3表达量均显著降低(P0.05);(5)透射电镜下可见Cd组CEF内有自噬体增多、内质网扩张、线粒体脊模糊,CCK-8检测结果显示细胞活力明显降低,而APS+Cd组的细胞形态、细胞活力均较Cd组有明显改善。综上,Cd可通过ROS诱导CEF自噬引起细胞损伤,而APS能够显著减少染镉CEF内ROS的产生、降低染镉CEF中LC3及Beclin-1蛋白的表达、提高mTOR的表达和抗氧化水平、恢复染镉CEF的细胞活力和形态损伤,表明APS可通过减少ROS生成减轻镉致CEF自噬诱导的细胞损伤。本研究为进一步探讨APS干预镉中毒导致机体损伤作用及机制提供了科学的实验依据。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.8

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本文编号：2786041