我国西北地区羊布鲁氏菌分子流行病学及抗原表位多肽的筛选

发布时间：2020-08-11 08:03

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由兼性细胞内寄生的布鲁氏菌(Brucella)引起的人兽共患烈性传染病,近年来在我国大部分地区再次流行,引起了严重的经济损失和公共卫生问题。本论文旨在分析我国西北地区羊布鲁氏菌分子流行病学,了解布鲁氏菌优势菌株及其菌株基因特征,追溯流行菌株的来源和变异情况;根据流行菌株基因组特征,选择保守的免疫抗原蛋白,筛选有针对性的抗原表位多肽。从我国西北新疆、青海、甘肃和内蒙古四省区一些地区采集羊和牦牛疑似感染布鲁氏菌病流产胎儿的脾脏样本480份,共分离鉴定布鲁氏菌菌株66株,其中马耳他布鲁氏菌3型58株,马耳他布鲁氏菌1型1株,流产布鲁氏菌1型2株,流产布鲁氏菌3型3株和猪布鲁氏菌3型2株;用MLVA和MLST基因分析技术,对66株布鲁氏菌菌株进行分子流行病学研究发现,66株布鲁氏菌分离株中包含46个MLVA16基因型,37株菌株拥有独立特有的基因型,有一株为新的基因型(基因型369),其中基因型116(n=49)和ST8(n=53)为优势的基因型。MLVA16分析66株分离株的亨特-加斯顿多样化指数(HGDI)表明,菌株间多样化水平为0.979;以MLVA11进行分子流行病学分析表明,我国马耳他布鲁氏菌流行菌株的主要基因型为116,分离株MLVA16的鉴定分析有助于深入了解西北地区动物布鲁氏菌病流行情况。首次对甘肃马耳他布鲁氏菌流行株分析发现,其流行菌株的种类、基因型无规律性。分子流行病学比较表明,人感染布鲁氏菌病主要来源于羊。甘肃庆阳地区2011-2015年间布鲁氏菌血清流行情况分析表明,布鲁氏菌年流行率在0.04%-4.75%之间,8个县区年均流行率在0%-9.96%之间,布鲁氏菌发病呈现上升趋势,差异明显;分离菌株分子流行病学结果表明,甘肃庆阳地区羊布鲁氏菌不仅有本地区周围的优势流行菌株,而且也存在外来菌株的混合感染。对分离于甘肃和青海的2株(羊源和牦牛源各1株)马耳他布鲁氏菌代表株全基因组测序分析,结果显示全基因组相对保守,长度为3.3Mb,有两个环状染色体,但基因组上也存在数量不等的特异基因。应用树突状细胞筛选布鲁氏菌种间保守的Omp16和L7/L12免疫蛋白潜在的抗原表位多肽,小鼠免疫评价结果表明omp16-1和L7/L12-4为T细胞抗原表位多肽,能刺激细胞和免疫动物发挥细胞免疫功能;omp16-5能够与布鲁氏菌阳性血清发生强烈反应,也能发挥体液免疫功能。总之,我国西北地区羊主要流行马耳他布鲁氏菌3型菌株,优势基因型为116(MLVA11)和ST8(MLST),布鲁氏菌菌株主要来自于东地中海布鲁氏菌群,基因组保守度高;应用DC能有效的筛选表位多肽抗原,并从Omp16和L7/L12蛋白上获得了理想的表位多肽。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.12
【图文】：

传播路线,布鲁氏菌,菌株,省份

图 1-1 不同省份 600 株布鲁氏菌菌株传播路线图Fig1-1 The sketch map of the 600 Brucella strains from different provinces in this studye 1 (yellow line): Inner Mongolia, Heilongjiang, Liaoning- Shandong- Hebei- Beijing-Guangdong provincee 2 (green line): Xinjiang, Ningxia, Qinghai-Shanxi-Henan-Zhejiang-Guangxi-Fujian-Hainan provinces. Lick line) Shanxi-Henan-Jiangxi-Guangxi-Yunnan provinces. The size of the blue circle represented the totalber of the isolated strains (in a circle). The sketch map does not represent an administrative map in the legase..2 MLST多位点测序分型(Multilocus sequencing typing，MLST)最早设计用于研究脑膜炎奈瑟Neisseria meningitides)的自然变异，后来被广泛的用于多种病原微生物和真核生物的研eng et al., 2011; Momeni et al., 2015)，该方法通过分析同一基因的等位基因核酸序列突到不同种型菌株之间的差异，其选择分析的序列往往是看家基因。看家基因在菌株中的存在，但不同菌株间又有极小的差异，通过测定看家基因的核苷酸序列，找到变分散于基因组内多个位点的变异情况，形成一种菌株共有的特征，从而将这些基因特组合与菌株进化建立起密切关系。MLST 设计往往是通过比较 GenBank 数据库菌株看

布鲁氏菌,布鲁氏菌病,抗原,分子流行病学研究

通过抗原刺激活化后，再次移入患者体内，激活产生特异的杀伤性 C胞(Saito et al., 2017)；新型的方法是通过抗原与 DC 表面受体融合方法原，体内免疫后通过 DC 抗原交互提呈能力，活化特异性杀伤 CD8+细一方面，DC 疫苗的作用往往需要配伍佐剂以增强其功能(Chen et al., 20e, 2014)。研究的目的和意义来，我国大部分地区出现布鲁氏菌病的再次流行，特别是在西北地区流采集我国西北地区疑似感染布鲁氏菌引起流产动物样本，进行细菌分离，全面了解我国西北地区布鲁氏菌流行的优势菌株及其菌株特征，追溯异情况，以及分析流行菌株的全基因组特征；根据我国布鲁氏菌流行选择广谱的免疫抗原蛋白为靶标，进行表位多肽抗原的筛选，为布鲁氏提供候选高效抗原。此外，通过我国动物布鲁氏菌分子流行病学研究和的分析，能为布鲁氏菌病防控中疫苗的选用提供有效的数据支撑。论文见图 1-2。

样本采集,布鲁氏菌

图 2-1 样本采集分别图Figure2-1. Distribution of samples.2 主要试剂及溶液布鲁氏菌血清葡萄糖琼脂（Brucella serum dextrose agar）和布鲁氏（Brucella Medium Base and Brucella Selective Supplement）；购自LTM布鲁氏菌培养基购自于每个 BD 公司；布鲁氏菌马血清；无菌的1 mol/L, pH 7.2)；硫化氢（H2S）检测试纸（醋酸铅）、硫堇(thionin, TH))检测试纸；生化检测用噬菌体(Tbilisi, Tb; Berkeley, Bk2; 和 Weybr异性抗血清由中国疫病预防与控制中心提供。DL2000TMDNAMarker、DNA 基因组提取试剂盒试剂盒和 EXTaq 扩增酶购自宝生物工试剂均为国产分析纯。布鲁氏菌血清葡萄糖琼脂（Brucella serum dextrose agar）成分（1 L胨（Peptone） 10 gb-Lemco’powder 5

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