山羊AP1M1基因的克
发布时间：2020-08-11 08:11
【摘要】：AP1M1基因(adaptor related protein complex 1 mu 1 subunit)编码衔接蛋白复合体AP-1A的μ1A亚基,属于衔接蛋白家族成员,在细胞内货物蛋白分选信号的识别机制上发挥着重要作用,参与了胞吐作用中分泌泡的形成、细胞膜上受体的循环等机体多种重要生理功能。睾丸作为机体重要的生殖器官,不仅是精子生成的场所,也是重要的内分泌器官。AP1M1影响小鼠和人的睾丸发育,可能参与雄性动物的繁殖。目前,有关AP1M1影响睾丸发育机制的研究报道还比较少,有待进一步的证据支持。本研究以大足黑山羊为研究动物,首次成功克隆了山羊AP1M1基因的编码序列,并在此基础上,制作了山羊AP1M1分子的多克隆抗体,之后检测了AP1M1的在成年大足黑山羊各组织及睾丸组织不同发育时期的表达量。相关研究结果如下:1、克隆了山羊AP1M1基因鉴于目前尚无山羊AP1M1基因序列报道,通过设计两对特异性引物,经序列拼接,首次成功克隆得到了山羊AP1M1基因序列(GenBank登录号:MH155258),其cDNA序列全长1 661 bp,开放阅读框为1 272 bp,编码423个氨基酸,预测分子量48.59 KD;序列分析表明该基因在进化上高度保守;含有5个蛋白质-蛋白质结合位点,不含蛋白质-核酸结合位点;有19个磷酸化位点,这些磷酸化位点可能对于AP1M1识别基于酪氨酸的分选信号“YXXΦ”起着重要作用;不含跨膜区,信号肽结构;含有一个网格蛋白衔接蛋白蛋白复合体小链(Clathrin adaptor complex small chain,Clat-adaptor)结构域和一个Adap-comp结构域。2、制备了山羊AP1M1分子的多克隆抗体为了对AP1M1的功能进行深入研究,构建了pET30a(+)-his-AP1M1原核表达载体。对诱导表达条件进行筛选,表明在0.2 mM IPTG,16℃,诱导20 h条件下诱导效果较好;重组蛋白主要以包涵体形式存在;对包涵体进行处理,结果表明包涵体经4 M尿素洗涤30 min,8 M尿素溶解,300 mM咪唑镍柱洗脱,可获得SDS-PAGE条带单一的目标蛋白;动物免疫后获得的抗血清经Western blotting和间接Elisa检测,表明成功获得了兔抗山羊的AP1M1多克隆抗体。3、分析了AP1M1在成年山羊不同组织以及睾丸发育各时期中的表达模式采用Q-PCR及Western blotting技术对AP1M1在山羊组织中的表达模式进行分析,结果表明AP1M1在各组织的转录水平和蛋白水平表达模式一致,其中在睾丸中表达量较高,且随着睾丸的发育,表达量有逐渐升高的趋势,体成熟时期达到最高,预示AP1M1与睾丸发育有关,可能参与了雄性动物的繁殖。本实验为进一步研究AP1M1分子的功能提供了理论基础,也为研究AP1M1在睾丸发育过程中的功能奠定了基础
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
【图文】：
AP）家族成员。蛋白质通过细胞质膜进出细胞是一个复杂的过程，衔接蛋白 AP 复合物作为结合网格蛋白和货物蛋白的“桥梁”，在囊泡外被形成及蛋白分选信号识别上起着重要作用[1-3]。1.1 衔接蛋白 AP1M1 概述1.1.1 衔接蛋白 AP 家族衔接蛋白 AP 是一类既能结合网格蛋白，又能与膜上受体结合的蛋白质，在物质的转运方面发挥着重要的作用，也称桥接蛋白，在进化上高度保守[2, 4-8]。AP 复合体是由两个大亚基（ 、β、γ、δ、ε 或 ζ），一个中等亚基（μ1、μ2、μ3、μ4 和 μ5)，一个小亚基链（σ1、σ2、σ3、σ4 和 σ5）构成的异源四聚体复合体（图 1.1）。在小鼠中，大亚基约为 100KD，中等亚基约 50KD，小亚基约 17KD[1, 9]。目前在哺乳动物中已经确定了 7 种类型的 AP 复合体，分别为 AP-1A、AP-1B、AP-2、AP-3A、AP-3B、AP4 和 AP-5（图 1.1），其中 AP-1A、AP-2、AP-3B、AP4 和 AP-5 广泛表达，而 AP-1A、AP-3B 则具有组织特异性[1]。除 AP 复合物外，还存在其他种类的衔接蛋白如 GGA（Golgi-localized，γ-ear-containing，Arf-bindingprotein）[10-12]。
西南大学硕士学位论文胞浆和腔内结构域信号[28-31]。Mathilde 发现，在促肾上腺皮tropetumorcells）中降低 AP1M1 的表达后，TGN 潴泡和非成，表明 AP1M1 对于分泌泡的形成起着重要的作用[32]。M1 在免疫系统中的作用1 参与了免疫系统中 CD4 分子受体再循环过程[33]。分子（cluster of differentiation 4，分化抗原 4）是一种主要存 I 型跨膜糖蛋白分子，在 T 细胞中，它与 T 细胞抗原受体（Tce作用于识别抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）上体 II（major histocompatibility complex II，MHC-II）分子呈peptide）[33]（图 1.3）。
实验技术路线
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
【图文】：
AP）家族成员。蛋白质通过细胞质膜进出细胞是一个复杂的过程，衔接蛋白 AP 复合物作为结合网格蛋白和货物蛋白的“桥梁”，在囊泡外被形成及蛋白分选信号识别上起着重要作用[1-3]。1.1 衔接蛋白 AP1M1 概述1.1.1 衔接蛋白 AP 家族衔接蛋白 AP 是一类既能结合网格蛋白，又能与膜上受体结合的蛋白质，在物质的转运方面发挥着重要的作用，也称桥接蛋白，在进化上高度保守[2, 4-8]。AP 复合体是由两个大亚基（ 、β、γ、δ、ε 或 ζ），一个中等亚基（μ1、μ2、μ3、μ4 和 μ5)，一个小亚基链（σ1、σ2、σ3、σ4 和 σ5）构成的异源四聚体复合体（图 1.1）。在小鼠中，大亚基约为 100KD，中等亚基约 50KD，小亚基约 17KD[1, 9]。目前在哺乳动物中已经确定了 7 种类型的 AP 复合体，分别为 AP-1A、AP-1B、AP-2、AP-3A、AP-3B、AP4 和 AP-5（图 1.1），其中 AP-1A、AP-2、AP-3B、AP4 和 AP-5 广泛表达，而 AP-1A、AP-3B 则具有组织特异性[1]。除 AP 复合物外，还存在其他种类的衔接蛋白如 GGA（Golgi-localized，γ-ear-containing，Arf-bindingprotein）[10-12]。
西南大学硕士学位论文胞浆和腔内结构域信号[28-31]。Mathilde 发现，在促肾上腺皮tropetumorcells）中降低 AP1M1 的表达后，TGN 潴泡和非成，表明 AP1M1 对于分泌泡的形成起着重要的作用[32]。M1 在免疫系统中的作用1 参与了免疫系统中 CD4 分子受体再循环过程[33]。分子（cluster of differentiation 4，分化抗原 4）是一种主要存 I 型跨膜糖蛋白分子，在 T 细胞中，它与 T 细胞抗原受体（Tce作用于识别抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）上体 II（major histocompatibility complex II，MHC-II）分子呈peptide）[33]（图 1.3）。
实验技术路线
【参考文献】
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本文编号：2788818
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