PRRSV诱导应激颗粒形成的机制研究

发布时间：2020-08-11 13:22

【摘要】：在热休克、饥饿、氧化应激、紫外线照射、缺氧或病毒感染等环境压力下,真核细胞的翻译被抑制,从而使mRNA(messenger RNA)和相关蛋白聚集形成一种无膜动态结构,这种结构被称为应激颗粒(Stress granules,SGs)。应激颗粒的主要功能是存储处于压力条件下细胞的mRNA,并保护其不被降解。应激颗粒的组成成分非常复杂,在不同压力条件下存在差异,且可能包含很多信号通路中的关键蛋白。因此,应激颗粒能参与多种信号通路的调控,进而影响很多疾病的发生及发展,例如肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等。G3BP1(RAS GTPase-activating protein SH3domain-binding protein 1)是应激颗粒的成核蛋白之一,也被证实是一种新型抗病毒因子,能够拮抗多种病毒的增殖。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是目前影响全球养猪业发展的重要疾病之一。因此,本文针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)开展了其调控应激颗粒形成的分子机制研究,发现PRRSV通过激活PERK(PKR-like endoplasmic reticulum kinase)诱导经典应激颗粒的形成,且利用自身编码的N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,进而逃避G3BP1的抗病毒作用。主要研究内容如下:1.PRRSV感染诱导经典应激颗粒的形成为了检测PRRSV感染是否诱导应激颗粒的形成,首先以应激颗粒的关键成核蛋白TIA1(T cell-restricted intracellular antigen 1)和G3BP1作为标志蛋白,通过间接免疫荧光实验检测病毒感染后不同时间点TIA1和G3BP1的聚集情况。结果显示,在病毒感染细胞中,TIA1和G3BP1均聚集成点状颗粒分散于细胞质中,且TIA1与G3BP1在PRRSV感染细胞中存在共定位,提示PRRSV感染诱导应激颗粒的形成。为了检测该颗粒是否是经典的应激颗粒,进一步检测了经典应激颗粒的标志蛋白翻译起始因子3η(eukaryotic initiation factor 3,eIF3η)在细胞中的定位。结果发现,在感染后期,eIF3η与G3BP1之间存在共定位,说明PRRSV诱导经典应激颗粒的形成;然而紫外灭活的PRRSV不能诱导应激颗粒的形成,表明PRRSV诱导应激颗粒的形成依赖于其正常复制。2.PRRSV通过PERK诱导应激颗粒的形成为了进一步分析PRRSV诱导应激颗粒可能的信号通路,通过Western blot实验发现,PRRSV感染上调eIF2α的磷酸化水平,推测PRRSV诱导应激颗粒形成依赖于eIF2α的磷酸化。eIF2α上游存在四种激酶,分别为PKR(protein kinase RNA-dependent kinase)、HRI(heme-regulated initiation factor 2αkinase)、GCN2(general control non-derepressible 2)及PERK。为了确定在PRRSV感染细胞中诱导eIF2α磷酸化的激酶,首先利用PKR特异性抑制剂C16及2-AP(2-aminopurine)处理细胞,发现C16及2-AP均不能抑制PRRSV诱导应激颗粒的形成;而用PERK抑制剂PERK-I(516535 PERK Inhibitor I,GSK2606414)处理细胞能显著降低PRRSV诱导应激颗粒的数量;另外,考虑到没有针对GCN2及HRI的特异性抑制剂,通过转染GCN2和HRI相应的siRNAs,发现干扰GCN2和HRI均不影响PRRSV诱导应激颗粒的聚集。以上结果说明PRRSV诱导应激颗粒的形成不依赖于PKR、GCN2及HRI,而是通过PERK途径。Western blot实验结果显示,只有PERK-I能抑制PRRSV上调的eIF2α磷酸化水平,而抑制PKR、干扰GCN2或HRI均对PRRSV诱导的eIF2α磷酸化水平无显著影响,进一步证实PRRSV诱导应激颗粒的形成依赖于PERK。3.应激颗粒及其组成成分G3BP1轻微抑制PRRSV增殖以前的研究证实同时干扰TIA1、G3BP1及TIAR(TIA1-related protein)的表达能显著抑制亚砷酸钠诱导应激颗粒产生。为了探讨应激颗粒形成对PRRSV增殖的影响,通过特异性siRNA同时干扰细胞的TIA1、TIAR及G3BP1,发现抑制应激颗粒形成只能轻微促进PRRSV增殖,但显著上调PRRSV诱导炎症因子的产生。应激颗粒的组成成分G3BP1被认为是一个新型抗病毒因子,但超表达或稳定表达G3BP1均只能轻微抑制PRRSV增殖。以上结果表明,应激颗粒及其组成成分G3BP1仅能轻微抑制PRRSV增殖,提示PRRSV可能拮抗应激颗粒及G3BP1的抗病毒作用。4.PRRSV N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而逃避其抗病毒作用本实验室前期通过PRRSV感染细胞的磷酸化蛋白质组学数据分析发现,PRRSV能上调G3BP1的磷酸化水平,本研究通过Western blot实验进一步证实了组学结果。为了检测G3BP1磷酸化修饰对PRRSV感染的影响,将其149及231位丝氨酸(S)残基突变为丙氨酸(A)或谷氨酸(E),分别模拟其去磷酸化(S149A/S231A)及磷酸化(S149E/S231E)状态。结果发现,S149A/S231A突变体抑制PRRSV增殖的能力较G3BP1野生型增强,而S149E/S231E突变体对PRRSV增殖无显著影响,提示PRRSV可能通过上调G3BP1的磷酸化水平,逃避G3BP1的抗病毒作用,但PRRSV通过哪种编码蛋白逃避G3BP1的抗病毒作用尚不清楚。从以前关于PRRSV N蛋白与宿主细胞蛋白相互作用组学的数据库中发现,N蛋白与G3BP1之间存在潜在的相互作用。本研究进一步通过Co-IP实验证实,在PRRSV感染或者N蛋白超表达条件下,G3BP1与N蛋白存在相互作用,且发现PRRSV N蛋白显著上调G3BP1的磷酸化水平。以上结果表明,PRRSV可能通过N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而拮抗G3BP1的抗病毒作用。总之,本研究对PRRSV感染细胞后的应激颗粒形成机制进行了研究,发现PRRSV感染细胞后应激颗粒标志蛋白TIA1、G3BP1、eIF3η在细胞质中聚集成点状颗粒,且存在共定位,表明PRRSV诱导经典应激颗粒的形成;随后发现PRRSV通过PERK上调eIF2α的磷酸化水平,诱导应激颗粒的形成;然而应激颗粒及其组成成分G3BP1仅能轻微抑制PRRSV增殖,进一步研究发现PRRSV能通过N蛋白上调G3BP1的磷酸化水平,从而拮抗G3BP1的抗病毒作用。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
【图文】：

应激,颗粒,复合物

华中农业大学 2019 届博士研究生学位论文initiation factor 2α kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; McEwen et al.2005)；热休克，病毒感染，紫外照射激活 PKR（protein kinase RNA-dependent kinase）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013; White et al. 2012)；位于内质网的未折叠蛋白激活 PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase）；氨基酸缺乏激活 GCN2（general control non-derepressible 2）(Anderson et al. 2008; Donnelly et al. 2013)。这四种激酶磷酸化 eIF2α 的 51 位丝氨酸，导致翻译起始所必须的 eIF2/tRNAiMet/GTP三元复合物减少，不能形成有功能的 48S 复合物，而是产生大量无功能的非经典 48S复合物。该复合物不能招募 60S 核糖体亚基，因此不能参与翻译，而是被招募进入应激颗粒，参与应激颗粒的组装(Kedersha et al. 2002c; Kedersha et al. 2013; Thomaset al. 2011)。另外，当 eIF4A 和 eIF4G 的功能被拮抗时，也能抑制翻译，从而诱导应激颗粒的形成，如 pateamine A 等药物能通过破坏 eIF4A 进而诱导应激颗粒的形成(Low et al. 2005; Mazroui et al. 2006; Thomas et al. 2011)。

应激,病毒诱导,信号通路

图 1-2 病毒诱导应激颗粒的信号通路 (McCormick et al. 2017)Fig. 1-2 The signaling pathway involved in induction of stress granules by virus大多数病毒均需要利用宿主细胞的翻译机制来合成病毒蛋白，因此，真核细胞进化出了各种机制来关闭翻译，以抵抗病毒感染。当宿主细胞被病毒感染时，eIF2α发生磷酸化，导致翻译起始被抑制，进而诱导应激颗粒形成。该途径可以迅速破坏病毒蛋白的合成，从而在宿主抗病毒蛋白的转录上调之前就能在一定程度上拮抗病毒增殖，因此，应激颗粒的形成被认为是一种重要的天然免疫防御机制。大多数病毒能通过抑制 eIF2α 的磷酸化而拮抗应激颗粒的形成，最终逃避应激颗粒的抗病毒作用(Cheng et al. 2005; Garcia et al. 2007)，例如单纯性疱疹病毒 1（Herpes Simplexvirus，HSV-1）的内切核糖核酸酶 VHS（virion host shutoff）抑制应激颗粒形成(Burgesset al. 2018)。此外，一些病毒利用内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites，IRES）起始翻译，该机制不依赖于 eIF2α 的磷酸化途径，所以当宿主翻译关闭时，病毒仍能通过eIF2α非依赖的方式合成蛋白，最终逃避应激颗粒的抗病毒作用(Jan et

示意图,基因组,示意图,衣壳蛋白

(Fang et al. 2012b; Li et al. 2014)。病毒基因组的 3’末端包含 8 个相对较小的基因，除了北美型 PRRSV 的 ORF4/ORF5，这些基因的 5’端和 3’端序列与邻近基因均有重叠（图 1-3），并编码四种膜相关糖蛋白（GP2a、GP3、GP4 和 GP5）、三种未糖基化的膜蛋白（E、ORF5a 和 M）和一种核衣壳蛋白（N）(Snijder et al. 2013)。

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