利用iTRAQ技术研究阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响

发布时间：2020-08-11 13:55

【摘要】：奶牛乳房炎不仅对奶牛业危害十分严重,而且也是导致奶牛淘汰的疾病之一。其中凝固酶阴性葡萄球菌如木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)引起的感染呈上升趋势,阻碍奶牛行业的未来发展。虽然凝固酶阴性葡萄球菌在传统观念上被定义为低致病性病原菌,但最近几年,全球很多地区凝固酶阴性葡萄球菌造成奶牛乳房炎的数量不断上升,而且木糖葡萄球菌能形成成熟的生物被膜(biofilm,BF),并且BF可以互相黏附或者黏附到生物活性或非活性物体表面,使生物被膜内细菌产生免疫逃避和耐药性,导致奶牛乳房炎的感染迁延不愈。因此,对木糖葡萄球菌生物被膜调控机制的研究,寻找新型药物作用靶标,提高奶牛乳房炎的预防和治疗效果,已成为国内外科研工作者关注的焦点之一。阿司匹林(Aspirin)别名乙酰水杨酸,是非甾体抗炎类药物,除具有退烧、解热和抗炎作用外,也能干预白色念珠菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌生物被膜的形成,但关于阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜形成的干预作用尚未见报道。故本研究拟通过iTRAQ技术,在1/2 MIC阿司匹林作用下筛选木糖葡萄球菌生物被膜形成的差异表达蛋白,为确定阿司匹林的作用靶标提供理论支持。在分析差异表达蛋白的基础上,进一步研究咪唑甘油磷酸酯脱水酶是否为阿司匹林的作用靶标。具体研究结果如下:(1)利用微量稀释法测定阿司匹林对木糖葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)为1.25 mg/mL;基于结晶紫染色和扫描电子显微镜的方法,揭示亚抑菌浓度的阿司匹林对生物被膜的干预作用,结果表明,1/2 MIC(0.625 mg/mL)、1/4 MIC(0.3125 mg/mL)、1/8 MIC(0.15625 mg/mL)和1/16 MIC(0.078125 mg/mL)的阿司匹林均能显著抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成,并且破坏生物被膜的立体结构。(2)基于蛋白质组学TRAQ技术,对1/2 MIC(0.625 mg/mL)阿司匹林干预木糖葡萄球菌生物被膜差异表达蛋白质进行定量分析,揭示阿司匹林可能的作用靶标。根据比值1.2or0.8(p-value0.05)的差异蛋白选择标准,共有178个差异表达蛋白被筛选并鉴定,其中67个(37.6%)蛋白上调表达,111个(62.4%)蛋白下调表达。在上述蛋白中,经过数据分析得到可能与生物被膜形成相关及在细菌代谢过程中发挥重要作用的蛋白,包括:咪唑甘油磷酸酯脱水酶(IGPD,A0A068E9J3)、组氨酸氨酶(huth,A0A060MSD4)、咪唑酮丙酸酶(hutI,A0A068E2P9)、尿刊酸水合酶(hutu,A0A068E633)、谷氨酰胺合成酶(GlnA,A0A068E8L1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,A0A060MH08)、磷酸谷胱甘肽酶(PGM,C6ZDJ7)、酮基酸还原异构酶(KARI,A0A068E468)、3-异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB,A0A068E3H6)和异柠檬酸脱氢酶(IDH,A0A090K7P3)。通过GO分析表明,大多数差异表达蛋白主要富集在代谢过程中。KEGG通路数据库分析发现大量的差异表达蛋白涉及氨基酸合成、碳代谢(磷酸戊糖和糖酵解途径,三羧酸循环)和氮代谢(组氨酸代谢)等途径,所以这些重要蛋白可能是阿司匹林干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的候选靶标。在上述差异蛋白中,咪唑甘油磷酸酯脱水酶参与氮代谢中的组氨酸生物合成,而组氨酸对生物被膜的形成有显著影响。所以本研究推测咪唑甘油磷酸酯脱水酶可能是阿司匹林的作用靶标,但是通过BIAcore分子互作试验,结果表明阿司匹林与IGPD在体外没有相互作用。综上所述,阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜的形成具有干预作用,并且对氮代谢和碳代谢有显著影响。虽然IGPD在组氨酸的生物合成过程中发挥重要作用,并且能够显著影响生物被膜的形成,但通过BIAcore分子互作验证,阿司匹林与IGPD在体外没有结合,说明IGPD不是阿司匹林的作用靶标。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

路线图,路线,试剂,反应管

图 2-1 RNA 提取路线路Figure 2-1 RNA extraction method2.2.5.2 cDNA 合成1、去除基因组 DNA 反应按下表比例加入各试剂，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA 样品。表 2-1 反应体系Table 2-1 Reaction system试剂使用量5×gDNA Eraser BuffergDNA EraserTotal RNARNase Free dH2OTotal2.0 μL1.0 μL5.0 μL2.0 μL10.0 μL

木糖葡萄球菌,阿司匹林,生物被膜,干预作用

图 3-1 亚抑菌浓度阿司匹林对木糖葡萄球菌生长的影响Figure 3-1 Effect of sub-MIC aspirin on growth curve of Staphylococcus xylosus3.3 亚抑菌浓度阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜形成的干预作用3.3.1 阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜影响通过结晶紫染色，在酶标仪 595 nm 波长下，测定 1/2 MIC（0.625 mg/mL）、1/4 MIC（0.3125mg/mL）、1/8 MIC（0.15625 mg/mL）和 1/16 MIC（0.078125 mg/mL）阿司匹林处理后生物被膜的 OD 值。如图 3-2 所示，OD 值随着药物浓度的增大而减小，呈负相关。经过 SPSS 软件分析，每个浓度的 OD 值与空白对照存在显著性差异，p<0.05。说明阿司匹林对木糖葡萄球菌的生物被膜有显著的干预作用。

木糖葡萄球菌,生物被膜,干预作用,阿司匹林

抑菌浓度阿司匹林对木糖葡萄球菌生物被膜形成的vention of subinhibitory concentration of aspirin on bioStaphylococcus xylosus木糖葡萄球菌生物被膜的形态影响镜（SEM），观察经过 1/2 MIC 浓度阿司匹林（0.6糖葡萄球菌 ATCC 700404 生物被膜。如图所示，A量黏附于盖玻片表面，形成具有蘑菇状三维立体结林（0.625 mg/mL）处理后，可明显观察到黏附于盖黏附。并且经药物处理后，细菌生物被膜的三维立可在体外对细菌生物被膜的形成有显著的干预作用

【参考文献】