表达兔出血症病毒vp60基因的重组犬2型腺病毒的构建及其免疫效力评价

发布时间：2020-08-12 03:35

【摘要】：兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起成年兔的一种急性、致死性、接触性传染病,以呼吸系统出血和急性肝坏死为特征,是造成养兔业巨大损失的一种重要传染病。本病于1984年首先在我国江苏省爆发,随即蔓延到世界各地。目前,免疫接种仍然是防治兔出血症的主要措施。由于RHDV没有适合培养的细胞系,现在商品化疫苗均为组织灭活苗。虽然灭活苗安全有效,但存在着成本昂贵、生物安全和动物福利等诸多缺点。因此,探索研制安全、有效、成本低廉的新型兔出血症疫苗具有现实意义。VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白和保护性抗原,在诱导抗病毒感染的免疫反应中发挥重要作用,是RHDV基因工程疫苗的首选蛋白。犬2型腺病毒(Canine adenovirus type 2,CAV2)是一种良好的病毒表达载体,具有易培养、重组病毒滴度高、外源蛋白表达量高等优点,对兔不致病,安全性好,可用于RHDV疫苗研发。本研究旨在构建表达RHDV vp60基因的E3区缺失的重组犬2型腺病毒r CAV2-VP60,并对其生长能力和遗传稳定性等生物学特性以及在兔体内的免疫效力进行评价,为研制RHDV新型病毒活载体疫苗奠定基础。本研究首先利用细菌内同源重组技术将CAV2 HLJ-10株的全基因组克隆到p Shuttle-CMV载体上,构建了含有CAV2全基因组的骨架载体p CAV2。其次,采用融合PCR方法将E3区侧翼序列(23903-24933bp和26412-28055bp)和pc DNA3.1(+)的CMV表达盒序列(232-1252bp)融合在一起,并将其克隆到p UC18载体上,构建了E3区缺失的穿梭载体p UC-ΔE3-CMV。在此基础上,将egfp基因定向克隆到穿梭载体p UC-ΔE3-CMV上,再利用穿梭载体和骨架载体共有的酶切位点Nru I和Sal I将含有egfp基因的表达盒克隆到骨架载体p CAV2上得到了重组病毒质粒p CAV2-EGFP,用特异性的内切酶Asc I酶切释放出重组基因组,转染MDCK细胞后获得了重组病毒r CAV2-EGFP。经鉴定该重组病毒能在MDCK细胞中稳定表达EGFP,一步生长曲线与亲本毒CAV2相似。这表明本研究利用p CAV2和p UC-ΔE3-CMV通过体外连接的方法构建重组犬2型腺病毒的策略是可行的,为下一步构建表达RHDV vp60基因的重组病毒r CAV2-VP60提供了技术平台。本研究利用PCR方法从质粒pc DNA-VP60中扩增出RHDV vp60基因,将其定向克隆到p UC-ΔE3-CMV中,再通过Nru I和Sal I特异性酶切位点将含有vp60基因的表达盒克隆到p CAV2中,获得了重组质粒p CAV2-VP60,用Asc I酶切释放出重组基因组后转染MDCK细胞成功拯救出重组病毒r CAV2-VP60。PCR鉴定显示vp60基因成功插入到r CAV2-VP60基因组中,将该重组病毒连续传代20次,PCR鉴定显示其具有良好的遗传稳定性;Western blot和IFA鉴定表明该重组病毒能在MDCK细胞中表达VP60蛋白,表达的VP60蛋白具有良好的抗原性;一步生长曲线表明其生长特性与亲本毒CAV2相似,病毒滴度最高可达107.5 TCID50/0.1m L。将此重组病毒r CAV2-VP60以107 TCID50/1m L接种RHDV非免疫兔,两周后加强免疫一次,同时与RHDV灭活苗和亲本毒CAV2进行免疫效果比较,结果表明r CAV2-VP60组和RHDV灭活苗组在加强免疫后1周均检测到RHDV特异性抗体,并于加强免疫后3周达到高峰,之后开始下降,攻毒后抗体又迅速升高。r CAV2-VP60组免疫兔的T淋巴细胞增殖水平和细胞因子IFN-γ、IL-4含量均高于亲本毒CAV2组。用致死剂量的RHDV HYD株滴鼻攻击后,r CAV2-VP60组和RHDV灭活苗组所有家兔均未死亡,没有出现典型的临床症状和病理变化,而亲本毒CAV2组所有家兔在攻毒后2天内全部死亡,临床症状及病理变化都很明显。综上所述,本研究成功构建了含有CAV2全基因组的骨架载体p CAV2和E3区缺失的穿梭载体p UC-ΔE3-CMV,利用此系统构建了表达RHDV vp60基因的重组病毒r CAV2-VP60,该重组病毒能在MDCK细胞中表达VP60蛋白,并具有良好的遗传稳定性,与亲本毒CAV2的生长特性相似。家兔试验表明,该重组病毒r CAV2-VP60能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫反应,免疫兔能够完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究为研制RHDV新一代病毒载体疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.291

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 徐力蛟,彭远义;兔出血症快速检测研究进展[J];中国动物检疫;1994年03期

2 ;兔出血症病毒在患兔各组织器官内的分布[J];畜禽业;1999年03期

3 郑东,XUETao,谌东华,郑明,ZHOUZheng-hong,徐伟;野生型兔出血症病毒空间结构的低温电镜术及像重构研究[J];电子显微学报;2000年03期

4 马吉飞,李佩国,史秋梅,董淑珍,高红珍;慢性兔出血症的研究[J];河北职业技术师范学院学报;2000年01期

5 刘来利,李元新,王必成;兔出血症病毒病原及诊断研究概况[J];甘肃畜牧兽医;2003年03期

6 付瑞,贺争鸣;兔出血症病毒分子生物学研究进展[J];实验动物科学与管理;2003年01期

7 王永山,陆承平,周宗安,陈兴祥;基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化[J];中国兽医学报;2004年03期

8 李海,彭远义;兔出血症病毒的研究进展[J];贵州畜牧兽医;2004年02期

9 刘俊林,胡永浩,伏小平,王若聪,姚学萍,包世俊,项光华;兔出血症病毒试验感染及临床病理学观察[J];甘肃农业大学学报;2004年04期

10 张玉颖;刘光清;吴润;;兔出血症病毒分子生物学研究进展[J];动物医学进展;2006年03期

相关会议论文 前10条

1 刘怀然;秦海斌;刘家森;司昌德;韩凌霞;姜骞;曲连东;;兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年

2 杨龙圣;薛家宾;王芳;徐为中;王德云;胡元亮;;兔出血症发病概况及疫苗研究进展[A];2007中国兔文化节“康大杯”兔业优秀科技论文、科普作品集[C];2007年

3 梁宏德;王瑞俭;杨玉荣;;兔感染出血症病毒后大肠的组织病理学观察[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年

4 严维巍;崔治中;王永坤;;在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（下）[C];2003年

5 杨艳;覃思群;曹娜;李成军;宋振辉;;兔出血症病毒RT-PCR检测方法的应用[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年

6 田浪;王红宁;黄勇;柳萍;廖娟;李建文;张夏兰;;兔出血症病毒的分离鉴定及RT-PCR检测方法的建立[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集（下）[C];2005年

7 田浪;王红宁;黄勇;柳萍;廖娟;李建文;张夏兰;;兔出血症病毒的分离鉴定及RT-PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

8 向华;宣华;王贵平;王文成;李尚波;;兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

9 王芳;李超美;杨龙圣;徐为中;张则斌;侯玉峰;陈国强;何孔旺;;兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[A];2007中国兔文化节“康大杯”兔业优秀科技论文、科普作品集[C];2007年

10 陈柳;倪征;刘光清;余斌;云涛;宋毅;华炯钢;李双茂;;兔出血症病毒病毒样颗粒(VLPs)的体外组装及其组分分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

相关重要报纸文章 前2条

1 楚雄市动物疫病防御控制中心 黎延莉 提供;兔出血症如何防治[N];云南科技报;2010年

2 楚雄市动物疫病预防控制中心 黎廷莉;怎么防治家兔出血症与大肠杆菌混合感染[N];云南科技报;2010年

相关博士学位论文 前4条

1 于作;表达兔出血症病毒vp60基因的重组犬2型腺病毒的构建及其免疫效力评价[D];中国农业科学院;2015年

2 肖跃强;兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用[D];吉林大学;2014年

3 李建文;兔出血症病毒WHNRH株全基因组测序全长cDNA克隆，VP60基因及全病毒真核表达载体构建[D];四川农业大学;2006年

4 王永山;兔出血症病毒中国早期流行毒株NJ85衣壳蛋白基因的分子结构特征及其表达应用[D];南京农业大学;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 朱杰;VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究[D];中国农业科学院;2015年

2 蔡少平;兔出血症病毒的单克隆抗体研制及其检测方法的建立[D];南京农业大学;2009年

3 赵文双;兔出血症病毒的分离、签定及疫苗研究[D];内蒙古农业大学;2001年

4 张秀娥;荧光定量PCR检测兔出血症病毒的研究及初步应用[D];山东农业大学;2006年

5 孙宏勇;兔铁蛋白重链与兔出血症病毒相互作用的研究[D];中国农业科学院;2013年

6 张玉颖;兔出血症病毒反向遗传研究系统的建立[D];甘肃农业大学;2006年

7 王玢tx;表达萤火虫荧光素酶报告基因的兔出血症病毒复制子的构建与应用[D];西北农林科技大学;2013年

8 王树坤;兔出血症病毒衣壳蛋白基因在家蚕中的表达[D];中国农业科学院;2012年

9 李茂中;人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析[D];中国农业科学院;2012年

10 杨廷亚;应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位及其ELISA抗体检测方法的建立[D];南京农业大学;2011年

本文编号：2789990