不同小分子抑制剂对牛类胚胎干细胞多能性维持的作用研究
发布时间：2020-08-12 03:56
【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由囊胚内细胞团经体外分化抑制培养后获得的一种高度未分化细胞,因其具有无限生长和多向分化潜能,在发育生物学、再生医学、疾病研究等方面呈现了广阔的应用前景。目前研究人员已培养获得小鼠、人、大鼠、猴等哺乳动物的ESCs,而家畜ESCs的分离和建系仍有待深入探索。家畜动物ESCs的研究有助于阐明胚胎早期发育机理和胚胎细胞多能性的调节机制,同时在家畜育种方面,尤其是与基因编辑相结合的遗传修饰动物的生产中具有重要价值。本研究以mTseR1干细胞培养液为基础培养液,以L Wnt-3A/MEF混合细胞作为饲养层,通过添加DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza C、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)抑制剂CHIR99021以及促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase kinase,MEK)抑制剂PD032901等药物的不同组合,对经免疫外科法分离的牛体外受精囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM)进行培养,探讨不同培养体系对牛类胚胎干细胞(bovine embryonic stem like cells,bESLCs)生长和多能性维持的影响。结果表明:1.与基础培养液(可传至第8代)相比,在经5AMT(5-Aza C)、2iMT(CHIR99021+PD032901)、3iMT(CHIR99021+PD032901+5-Aza C)组合培养后,bESLCs的传代次数均有提高,最高传代次数分别达到第15代、第12代和第17代,其中添加5-Aza C的培养体系(5AMT组和3iMT组)能显著提高ICM细胞的贴壁率和原代克隆形成率,5AMT、2iMT、3iMT培养体系中细胞克隆能够更长时间保持未分化形态。四种培养体系所获得的bESLCs克隆均呈扁平形态,细胞边缘清晰且具有正常的核型,呈碱性磷酸酶染色阳性。其中,3iMT培养体系中的bESLCs能表达NANOG、OCT4、SOX2、CDX2、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能性标志因子,并能在体外分化培养后形成类胚体,免疫荧光检测表明类胚体细胞表达三个胚层的特异蛋白。上述结果表明我们获得bESLCs具有ESCs的基本特征。为探讨四种培养体系所获得的bESLCs多能性差异及不同小分子抑制物的作用,本研究通过实时定量PCR检测了四种培养体系中第五代bESLCs的多能性相关基因的表达,结果表明添加5-Aza C的培养体系中(5AMT、3iMT)bESLCs的OCT4、NANOG、SOX2、STAT3基因的表达有显著提高,2iMT培养体系中SOX2表达也有上升。随后用亚硫酸氢盐PCR方法检测了四种培养体系中bESLCs的多能性基因NANOG和SOX2启动子区DNA甲基化状态。结果表明,与对照组相比,药物处理组NANOG启动子区甲基化状态没有差异,而SOX2基因启动子区DNA发生明显去甲基化,且差异显著。上述结果表明2i和5-Aza C能够有效促进bESLCs多能性相关基因表达。bESLCs在以上体系中培养及传代过程中形成不同形态的克隆,本研究比较了不同克隆形态、传代方法等对细胞多能性的影响。bESLCs克隆的中间区域(central multilayer,CMt)和边缘区域(peripheral monolayer,PMn)细胞有明显形态差异,且CMt区域细胞碱性磷酸酶染色着色更深。通过实时定量PCR检测发现CMt中多能性基因OCT4、NANOG和SOX2的表达水平显着高于PMn区域细胞,而PRDM14、OTX2和滋养层细胞标志基因CDX2的表达模式正好相反,因此本研究只挑取CMt细胞进行传代。通过对比不同代次的bESLCs克隆形态,表明随着代次提高,细胞克隆会变得透明、边缘不清晰,细胞中多能性基因NANOG、SOX2、C-MYC表达有显著降低,OCT4表达并无差别,而CDX2、STAT3、EZH2表达量有显著提高。此外还对比了立体形态和扁平形态克隆中bESLCs的多能性相关基因表达,实时定量PCR结果表明两种形态克隆bESLCs之间OCT4、GATA6、C-MYC m RNA表达量并无差异,立体状克隆bESLCs中NANOG、SOX2、CDX2、CDH1、FGFR2表达量的表达量低于扁平状克隆bESLCs,而STAT3、CDH2的表达量高与扁平克隆bESLCs。综上所述,本研究表明5-AMT、2iMT和3iMT培养体系中培养的bESLCs具有ESCs基本特征,添加5-Aza C可以提高bESLCs的分离效率,2i抑制剂和5-Aza C能够有效促进bESLCs多能性标记表达并抑制其分化。综合细胞生长状态、传代次数、多能性基因表达等,3iMT培养体系更适合bESLCs的体外培养和多能性维持。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 2.1 牛类胚胎干细胞的传代过程。Figure 2.1 Passage of Bovine Embryonic Stem like Cells.磷酸酶染色长旺盛的第 5 代 bESLCs，用 PBS 洗三次，加入 4%多聚甲醛室温固定 10 m胞用 PBS 洗三次，再根据试剂盒说明书向每 5 mL 碱性磷酸酶缓冲液（100 mM MgCl2，150 mM NaCl）中按顺序加入 33 μL NBT 和 16.5 μL BCIP 迅速，避光染色 10-40 min。不断观察染色结果，显色后上镜拍照。荧光染色荧光染色的细胞需要接种在放盖玻片的四孔板中。操作如下:取传代第4-5天洗一次，向孔内加入 4％多聚甲醛室温固定 10 min，固定后用 PBS 洗 3 次，每PBS 洗均为 5 min）。通透:加入 0.8％ Triton-X100 室温通透细胞 20 min，用闭：加入封闭液（用 DPBS 稀释的 10%山羊血清或加入 1%BSA 的 PBS）室一抗：用封闭液按比例稀释一抗，用封口膜包好 4°C 过夜。孵育二抗:用移
内蒙古大学 硕士学位论文表 2.8 牛囊胚 ICM 来源的细胞在不同培养体系中的培养情况Table2.8 The cells from bovine blastocysts ICM in different culture systems培养体系 内细胞团 贴壁率（%） 原代克隆形成率（%） 最高代次Culture system ICM Adhesive rate Primary clone-forming rate Highest passagesMT 30 16(53) 11(36) P85AMT 39 31(79) 16(41) P152iMT 40 23(58) 16(40) P123iMT 33 29(88) 16(48) P17四种培养体系中分离获得 bESLCs 的传代次数也具有明显差异。在传代过程中有的克隆稳定传代，有的克隆在传代初期就会表现生长缓慢，克隆变得比较透明，最终死亡。在 MT体系中 bESLCs 最高可传到第 8 代，而在 5AMT、2iMT、3iMT 体系中分别最高可传到 15、12、17 代，其中 3iMT 培养体系中 bESLCs 平均传代次数较高。
图 2.3 四种培养体系中 bESLCs 的形态。（图中标尺为 100 μm)Fig 2.3 The morphology of bESLCs in four culture systems.（The scale bar is 100 μm）1.3 牛类胚胎干细胞增殖检测通过 Brdu 荧光检测发现我们获得四种培养体系 bESLCs 克隆的 CMt 区域和 PMt 区域均有 Brdu 阳性细胞的存在，表明 bESLCs 在四种培养体系中都能够在正常增殖（图 2.8）。
本文编号：2790013
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 2.1 牛类胚胎干细胞的传代过程。Figure 2.1 Passage of Bovine Embryonic Stem like Cells.磷酸酶染色长旺盛的第 5 代 bESLCs，用 PBS 洗三次，加入 4%多聚甲醛室温固定 10 m胞用 PBS 洗三次，再根据试剂盒说明书向每 5 mL 碱性磷酸酶缓冲液（100 mM MgCl2，150 mM NaCl）中按顺序加入 33 μL NBT 和 16.5 μL BCIP 迅速，避光染色 10-40 min。不断观察染色结果，显色后上镜拍照。荧光染色荧光染色的细胞需要接种在放盖玻片的四孔板中。操作如下:取传代第4-5天洗一次，向孔内加入 4％多聚甲醛室温固定 10 min，固定后用 PBS 洗 3 次，每PBS 洗均为 5 min）。通透:加入 0.8％ Triton-X100 室温通透细胞 20 min，用闭：加入封闭液（用 DPBS 稀释的 10%山羊血清或加入 1%BSA 的 PBS）室一抗：用封闭液按比例稀释一抗，用封口膜包好 4°C 过夜。孵育二抗:用移
内蒙古大学 硕士学位论文表 2.8 牛囊胚 ICM 来源的细胞在不同培养体系中的培养情况Table2.8 The cells from bovine blastocysts ICM in different culture systems培养体系 内细胞团 贴壁率（%） 原代克隆形成率（%） 最高代次Culture system ICM Adhesive rate Primary clone-forming rate Highest passagesMT 30 16(53) 11(36) P85AMT 39 31(79) 16(41) P152iMT 40 23(58) 16(40) P123iMT 33 29(88) 16(48) P17四种培养体系中分离获得 bESLCs 的传代次数也具有明显差异。在传代过程中有的克隆稳定传代，有的克隆在传代初期就会表现生长缓慢，克隆变得比较透明，最终死亡。在 MT体系中 bESLCs 最高可传到第 8 代，而在 5AMT、2iMT、3iMT 体系中分别最高可传到 15、12、17 代，其中 3iMT 培养体系中 bESLCs 平均传代次数较高。
图 2.3 四种培养体系中 bESLCs 的形态。（图中标尺为 100 μm)Fig 2.3 The morphology of bESLCs in four culture systems.（The scale bar is 100 μm）1.3 牛类胚胎干细胞增殖检测通过 Brdu 荧光检测发现我们获得四种培养体系 bESLCs 克隆的 CMt 区域和 PMt 区域均有 Brdu 阳性细胞的存在，表明 bESLCs 在四种培养体系中都能够在正常增殖（图 2.8）。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 孙国杰,桑润滋,韩建永,金东航,田树军,周振明,李俊杰;山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究[J];河北农业大学学报;2003年03期
本文编号：2790013
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