【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种危害极大的禽类传染病,该病的流行给全世界的养禽业带来了巨大的损失,19世纪曾发生过鸡群的大量死亡,后来科学家将这种疾病称为禽流感。随着禽流感的流行,现在禽流感病毒(AIV)已经出现了很多种亚型,其中H9N2亚型是其中的一种低致病性的亚型病毒,在漫长的时间里,H9N2已经是较流行的禽流感病毒的亚型之一,所以如何预防禽流感一直是研究热点。血凝素(Hemagglutinin,HA)是AIV上的重要蛋白,AIV侵袭细胞的关键。研究表明,HA在机体内分解出HA2,HA2是重要的保守性抗原,一直是研究通用型疫苗的研究热点。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)在抗原呈递过程中发挥重要的作用,CD205/DEC-205是DCs表面上的C型凝集素跨膜蛋白,DEC-205充当内吞受体时,它加强DC的抗原摄取以及抗原递呈作用,目前已有很多文献证明了DEC205在抗原靶向DC过程中起到了这一作用。目前市场上流行的大多是全病毒灭活疫苗,且疫苗主要是通过鸡胚培养或者是细胞培养的方式得到。但鸡胚培养方式工艺复杂且一定程度上易残留卵清蛋白,对鸡蛋过敏的是不能通过这种方式获得免疫的,细胞培养的方式容易污染且成本较高。所以研究出既安全又简便的禽流感疫苗是一个重要的问题。本实验研究的是通过减毒延迟裂解型沙门菌递送禽流感HA2抗原预防H9N2型禽流感的DNA疫苗。本实验具体研究内容如下及结果如下:(一)靶向DCs的H9N2亚型禽流感病毒HA2抗原的裂解型沙门菌构建及反应原性研究。以合成的质粒αDEC205-HA为模板,利用PCR扩增技术得到目的片段scFvDEC205-HA2和scFvDEC205-HA2-dimer,其中dimer是一种二聚体,可以结合双倍的scFvDEC205和HA2,把这两个目的片段与pYA4545载体连接构建出真核表达质粒pYA4545-HA2-scFvDEC205和pYA4545-HA2-scFvDEC205-dimer,分别命名为HA2-scFv DEC205和HA2-scFvDEC205-dimer,中提质粒以脂质体3000转染状态良好的HEK-293T细胞中,培养48h后提取总蛋白,Western-blot和间接免疫荧光验证目的蛋白成功表达后将质粒转入沙门菌χ11218,分别命名为pYL9,pYL11。(二)沙门菌pYL9和pYL11的免疫效果研究。将60只小鼠随机分成6组,每组10只小鼠,分为已构建好的pYL9和pYL11和实验室已有的χ11218(pYA4545)组(Empty vector组)、χ11218(pYA4545-HA2)组(HA2组),同时设立生理盐水组(Saline组)和灭活疫苗组(Vaccine组),除了Vaccine组外,其余各组在第一次免疫后在每隔14天加强免疫一次,一共口服免疫4次,剂量为1×10~9CFU/只。其中Vaccine组的小鼠在第一次免疫时采用颈部皮下注射的方式进行免疫且只免疫一次。在第四次免疫后取小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和PP结,通过流式细胞术检测分析各组小鼠的DCs成熟分化情况以及T细胞分化情况,在免疫的第21和35天分别取小鼠血清,利用ELISA检测小鼠血清中抗体滴度以及细胞因子的水平,四次免疫的一周后每组随机挑选出7只小鼠进行攻毒试验,攻毒剂量10~5EID_(50)即50μL/只,攻毒后14天内记录小鼠的体重变化以及死亡率,攻毒的14天后取小鼠肺部制作肺部的病理切片,观察各组小鼠肺部的病理损伤情况。结果显示:本实验构建表达沙门菌pYL9和pYL11免疫小鼠后发现与Saline组和Empty vector组相比小鼠脾脏中CD3~+CD4~+T细胞比例显著上升5.1%,5.4%(P0.01),且与Empty vector组和HA2组相比pYL11组的CD3~+CD4~+T细胞中IL-4~+细胞占比显著上升了1.49%,1.63%(P0.05),与Empty vector组相比pYL11组CD3~+CD4~+T细胞中IFN-γ~+细胞含量显著升高了1.25%(P0.01),与HA2组相比pYL11组IFN-γ~+细胞含量显著升高了1.61%(P0.001);与Saline组相比pYL11组脾脏中CD3~+CD8~+T比例也显著上升了2.56%(P0.01)且与Empty vector组相比pYL11组的IFN-γ~+T细胞含量显著升高了0.49%(P0.05)。脾脏中与Empty vector组相比pYL11组的DCs的CD83表达显著增多了0.41%(P0.05),CD86表达显著增多了34.8%(P0.001),肠系膜淋巴结中与Empty vector组相比pYL11组的DCs的CD80表达显著增多了1.67%(P0.05),PP结中与Empty vector组相比pYL11组的DCs的CD80表达显著增多了0.42%(P0.05)。ELISA分析血清中抗体滴度和细胞因子水平结果表明:在免疫的第21和35天时,与Empty vector组相比pYL11组的抗体滴度显著升高了0.6%,0.28%(P0.05),与HA2组相比pYL11组血清中IFN-γ含量显著升高了(P0.01)。攻毒后各组小鼠体重均开始下降,第七天时体重降到最低,pYL11组体重下降幅度较轻,生存曲线结果表明,pYL11组存活率为85.7%,Vaccine组的存活率也为85.7%,Empty vector和Saline组分别为57.1%和28.5%。各组小鼠肺部病理切片的HE染色结果说明,pYL11组和pYL9组还有Vaccine组的病理变化较轻,Saline组和Empty vector组的小鼠肺部均有严重的肺部间质增厚,炎性细胞浸润增多的现象。综上所述,免疫小鼠后减毒沙门菌pYL9和pYL11组小鼠的CD3~+CD4~+T细胞和CD3~+CD8~+T细胞占比显著上升,且IL4~+T细胞和IFN-γ~+T细胞含量都显著上升,DCs表达的CD80、CD83、CD86显著上升,血清中抗体水平上升,攻毒后小鼠沙门菌组小鼠的肺部病变程度要轻于对照组,说明沙门菌pYL9和pYL11对小鼠抵抗H9N2感染具有一定的保护效果,其中pYL11组效果更佳。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：
图 2：HA2-scFvDEC205 基因片段的扩增子质量标准；1：HA2-scFvDEC205 基因片段的ig.2Amplification of HA2-scFvDEC205 geneAMarker；1：Product for HA2-scFvDEC205 gedimer 基因的 PCR 扩增 的基因片段，其大小与设想的一致（见图2010bpM 15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp
HA2-scFvDEC205 基因片量标准；1：HA2-scFvDEmplification of HA2-scFvDrker；1：Product for HA2 基因的 PCR 扩增因片段，其大小与设想M 1
pYA4545-HA2-scFvDEC205 菌落 PCR 鉴定准；1：HA2-scFvDEC205 基因片段；2：阴性；3：阳性545-HA2-scFvDEC205 colony PCR identificationker; 1: HA2-scFvDEC205 gene fragment; 2 : negative contro3:positive controlM 1 2 32010bp
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