肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及比较基因组学分析
发布时间：2020-08-13 02:12
【摘要】：肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是在肠道中定植,而在肠道外引起疾病的一类大肠杆菌,因其特有的毒力因子可引起人和动物不同类型的疾病。动物源性ExPEC造成养殖业严重的经济损失,也有公共卫生意义。本研究通过对疑似ExPEC感染的禽、猪和水貂进行病原分离鉴定,以明确我国某地区动物源性ExPEC流行菌株的生物学特性。在此基础上选择代表性菌株通过比较基因组学分析,预测可能的毒力基因和特有基因,为ExPEC的分子致病机制的研究奠定基础,也为ExPEC感染的防控提供理论依据。本研究首先从132份禽、猪和水貂肠道外组织中分离鉴定大肠杆菌,其中53个分离菌株至少携带特异性毒力基因pap、sfa/foc、afa/dra、iutA和kpsMT II中的两种基因,并携带fimH、ibeA、hlyA、malX、iss和iroN等其它相关毒力基因,表明为ExPEC;分离菌株对氯霉素、卡那霉素和多粘菌素B等15种抗生素呈现不同程度的多重耐药性;O抗原主要分布于O1、O2、O8、O11、O38、O78和O120血清型;系统进化分析表明53株ExPEC分离菌株主要属于A群和B1群,其中28株属于A群,19株属于B1群。选取代表性ExPEC分离菌株20株,以不同感染剂量腹腔注射小鼠进行致病性分析,结果表明其中ExPEC分离菌株11株在剂量3×10~7 CFU/只可致所有感染小鼠死亡,对ExPEC53、ExPEC52、ExPEC42和ExPEC6分离菌株进行了毒力测定,结果表明对小鼠的LD_(50)分别为2.38×10~7 CFU/mL,9.48×10~6 CFU/mL,9.49×10~5 CFU/mL和3.49×10~6 CFU/mL。采用Illumina HiSeq技术对ExPEC53和ExPEC52水貂源分离菌株及ExPEC5猪源分离菌株进行了全基因组测序,ExPEC53和ExPEC52全基因组中分别包含1个长度98,080 bp和207,975 bp的质粒,均携带四环素抗性基因,而ExPEC5全基因组不包含质粒。ExPEC53、ExPEC52和ExPEC5分离菌株预测分别包含747、667和703个毒力基因并主要参与细菌的侵袭黏附、分泌系统和铁离子摄取系统;未知功能蛋白数量分别为232、242和232。与参考菌株PCN033(CP006632)基因组相比,ExPEC53、ExPEC52和ExPEC5分离菌株特异基因数量分别为718、393和239个,基因组分别存在365、367和339个插入缺失片段(长度≤50 bp),编码区分别存在6,541、6,498和6,493单核苷酸多态性非同义突变。聚类分析并构建进化树,结果显示ExPEC52和ExPEC5分离菌株与菌株PCN033进化位置较近,ExPEC53分离菌株次之。综上所述,本研究分离鉴定到ExPEC分离菌株53株,明确了其多重耐药性、O抗原、系统进化特性及对小鼠的致病性;选取ExPEC水貂源分离菌株和猪源分离菌株且血清型为O11的3个分离菌株进行了全基因组重测序及比较基因组学分析,对其基因组结构、特有基因和毒力基因特征等进行了预测和分析,为ExPEC的分子致病机制的研究奠定基础,也为ExPEC感染的防控提供了理论依据。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.612
【图文】：
株的 O 抗原血清检测菌株按照大肠杆菌 O 抗原血清检测说明书，分O38、O78、O81、O101、O120、O138、O16：上生长的单个菌落于 2 mL 的 LB 液体培养基内各取 10 μL 新鲜菌液，分两次滴加到载玻片杆菌 O 抗原血清滴加至载玻片菌液充分混合均位置做空白对照。混合载玻片上的两种混合液，大约 1 min。图 2-1 大肠杆菌群系鉴定标准ichotomous decision tree to determine phylogenetic grou
肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及比较基因组学分析的鉴定分离 E. coli 菌株的基因组为 PCR 模板，通过设计 16S rRNA 引物对菌株进所得 PCR 产物经 0.8-1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示目的条带大小约预期试验结果相符（图 2-3 为 ExPEC6、ExPEC42-45 和 ExPEC51-53 分离菌测序后与 NCBI 中已报道 E. coli MG1655 标准菌株的 16S rRNA 序列进行比 99%以上，表明分离株均为 E. coli。M 1 2 3 456789
有效 reads 数、总分之一错误碱基率，Q30%表2 3 个分离菌株原始测序数据过滤nd statisticd sequencing data of orig基数（bp） 有效 Reads 数 有效2951300 10598708 9873600 9107362 0258700 8871718 3-1 3 个分离菌株 PCR 鉴定结株；2：ExPEC52 株；ExPEC5 株；-1 PCR identification results of 3 in; 2: ExPEC52 strain; 3: ExPEC5 st
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.612
【图文】：
株的 O 抗原血清检测菌株按照大肠杆菌 O 抗原血清检测说明书，分O38、O78、O81、O101、O120、O138、O16：上生长的单个菌落于 2 mL 的 LB 液体培养基内各取 10 μL 新鲜菌液，分两次滴加到载玻片杆菌 O 抗原血清滴加至载玻片菌液充分混合均位置做空白对照。混合载玻片上的两种混合液，大约 1 min。图 2-1 大肠杆菌群系鉴定标准ichotomous decision tree to determine phylogenetic grou
肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及比较基因组学分析的鉴定分离 E. coli 菌株的基因组为 PCR 模板，通过设计 16S rRNA 引物对菌株进所得 PCR 产物经 0.8-1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示目的条带大小约预期试验结果相符（图 2-3 为 ExPEC6、ExPEC42-45 和 ExPEC51-53 分离菌测序后与 NCBI 中已报道 E. coli MG1655 标准菌株的 16S rRNA 序列进行比 99%以上，表明分离株均为 E. coli。M 1 2 3 456789
有效 reads 数、总分之一错误碱基率，Q30%表2 3 个分离菌株原始测序数据过滤nd statisticd sequencing data of orig基数（bp） 有效 Reads 数 有效2951300 10598708 9873600 9107362 0258700 8871718 3-1 3 个分离菌株 PCR 鉴定结株；2：ExPEC52 株；ExPEC5 株；-1 PCR identification results of 3 in; 2: ExPEC52 strain; 3: ExPEC5 st
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本文编号：2791364
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