塞尼卡谷病毒CH-LZ-2017株的分离及qRT-PCR检测方法的建立

发布时间：2020-08-13 02:25

【摘要】：塞尼卡谷病毒(SVV)作为一种无囊膜的单股正链RNA病毒,属小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒属(Senecavirus),目前所知其为唯一成员。主要引起猪鼻吻、冠状带、蹄部水疱样病变和新生仔猪死亡,偶见腹泻症状。SVV全基因组约7.2 kb,主要编码4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D),其中VP1作为小RNA病毒科免疫原性最强的蛋白,发挥着重要的作用。2015年,我国广东省某猪场突然暴发了猪水疱性疾病,临床表现为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡、厌食、跛行,新生仔猪急性死亡,经证实是感染SVV所致。2017年,在甘肃兰州某猪场相继发生水疱性疾病。本研究从该猪场采集相关病料样品,采用PCR方法扩增SVV的VP1基因,表明该该病料为SVV阳性。将病料接种PK-15细胞后分离到1株SVV,命名为CH-LZ-2017。此外基于VP1基因构建SVV种系发育树,表明CH-LZ-2017与CH-HN-2017亲缘关系最近,但与部分美国分离的毒株在VP1基因上存在明显差异。SVV感染猪后与口蹄疫、猪水泡病、水泡性口炎、猪水疱疹等疾病一样能使猪发生水疱性病变,如果不能及时作出准确的鉴别诊断,将无法对猪群采取正确的防控措施,将导致猪群生产性能下降、增加养殖成本。为建立一种灵敏、特异的SVV检测方法,本研究针对SVV高度保守的3D区域设计了一对引物和探针,建立了SVV的qRT-PCR检测方法。研究结果表明经传统RT-PCR和qRT-PCR鉴定均为阳性的组织样品,qRT-PCR鉴定时Cq值12~32.3个循环。组织样品只能通过qRT-PCR鉴定出阳性结果的Cq值范围27.6~36.8循环。本研究建立qRT-PCR提高了检测SVV的灵敏性和特异性,为今后我国对SVV的快速鉴别诊断提供技术支持。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

病料,细胞病变

（1）将鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工进行测序。将测序结LAST 检索。（2）应用 MEGA5.0 软件分别进行全基因组的系统发育分析，采用法（Neighbor-Joining）构建进化树，并用 Bootstrap 值来评估进化树的可3 结果与分析3.1 SVV 的分离与鉴定.1.1 SVV 的分离当 SVV 在 PK-15 细胞盲传至 8 代时，接毒 1d 后，部分细胞脱面；在接毒 2d 后，细胞病变达 80%以上，呈现规律性的细胞病变（见

侧样,病毒,病毒病,盲传

Fig.1.2 PPK -15 cells were inoculated with suspected samplesV 的鉴定K-15 细胞连续盲传 6 代疑似塞内卡谷病毒病料的病毒液（标F4，F5 和 F6）提取 mRNA，采用 RT-RCR 方法，扩增塞内，结果表明扩增片段大小约为 1000bp，与预期相符，而阴性带（见图 2）。1，F2，F3，F4，F5 和 F6 测序结果在 NCBI 中进行 BLAS疑似病料为塞内卡谷病毒，且其与 Senecavirus A isolate CH最近（见图 3）

测序,样品,病毒,病毒病

Fig.1.2 PPK -15 cells were inoculated with suspected samples3.1.2 SVV 的鉴定将 PK-15 细胞连续盲传 6 代疑似塞内卡谷病毒病料的病毒液（标记为 F1，F2，F3，F4，F5 和 F6）提取 mRNA，采用 RT-RCR 方法，扩增塞内卡谷病毒VP1 基因，结果表明扩增片段大小约为 1000bp，与预期相符，而阴性对照未见到扩增条带（见图 2）。将 F1，F2，F3，F4，F5 和 F6 测序结果在 NCBI 中进行 BLAST 检索，结果表明疑似病料为塞内卡谷病毒，且其与 Senecavirus A isolate CH-HN-2017亲缘关系最近（见图 3）

【参考文献】