家庭式养殖地区多环境介质中携带mcr-1大肠埃希菌的流行特征

发布时间：2020-08-13 13:16

【摘要】：背景及目的抗生素耐药已经成为全球普遍关注、亟待解决的重大问题。中国是抗菌药物不合理应用情况较为严重的国家之一,细菌耐药形势十分严峻,面对耐药菌引起的健康威胁,迫切需要加强多领域合作以协同谋划、共同应对。在“One-Health”观点中,环境处于“动物-环境-人类”这一整体的中心,在耐药菌的传播过程中扮演着重要角色,不仅可作为耐药基因和耐药菌的储存库,同时还是它们传播的重要途径。在环境领域,目前关于耐药菌的研究多集中于单一环境介质,缺乏环境中多介质传播的整体性研究。在中国畜禽养殖区,由于缺少处理禽畜粪便的专门设施,导致养殖废弃物直接排放到周围环境中。因此,在我国目前的养殖模式下,畜禽废弃物的不合理处置会导致养殖周边环境哪些介质中出现耐药菌,及其在环境多介质中的潜在传播规律,成为当前环境领域耐药菌研究急需阐明的问题。多粘菌素曾被认为是治疗铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍氏不动杆菌等一系列革兰氏阴性菌感染的最后防线,但随着抗生素滥用,导致多种细菌均能携带粘菌素抗性基因mcr-1,使得这一观点受到严重冲击。虽然目前研究发现mcr-1仅导致中低程度的粘菌素耐药,但并不能认定其没有继续发展甚至导致高水平耐药的风险。综上,为掌握我国农村家庭式养殖地区环境中携带mcr-1的大肠埃希菌的流行病学特征,本研究对山东省农村家庭式养殖地区的多种环境介质(水、土壤、蔬菜等)展开调查,探讨携带mcr-1的大肠埃希菌分布情况及分子生物学特征,为制定细菌感染性疾病的相关防控策略和措施提供理论依据。方法本研究于2015年7月开始进行,统一收集了山东省某家庭式养殖地区的12个村庄的环境样品,包括猪粪便、废水、排污口沉积物、饮用水、河水、河流沉积物、土壤、蔬菜;通过分离、筛选和鉴定耐药菌,分离出携带mcr-1基因的大肠埃希菌;通过药敏试验确定菌株的耐药表型;通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)技术对菌株的同源性进行分析;通过质粒的脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)和DNA印记染色(Southern blot)确定mcr-1基因是否位于质粒及所在质粒大小,通过基于PCR的质粒不相容性分组(PBRT)实验确定携带mcr-1的质粒类型;通过全基因组测序分析(WGS)获得目的菌株的耐药基因型、毒力基因以及mcr-1的基因环境。结果1.共分离出89株产ESBL大肠埃希菌,其中17株携带mcr-1基因,阳性率为19.1%。除土壤外,其他环境介质如猪粪便、废水、饮用水、河水、河流沉积物、蔬菜、排污口沉积物中均有mcr-1阳性菌株的检出。大部分携带mcr-1的大肠埃希菌对粘菌素、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻肟、四环素和氟苯尼考耐药,对美罗培南和替加环素敏感;所有菌株均为多重耐药菌,且携带多种耐药基因。2.MLST结果显示17株菌株分属12个ST型,除本次研究新检出的两个型别外,所有ST型的菌株均有在人类、动物、环境中检出的报道。PFGE结果显示有两对菌株同源性80%,分别为EF6(检出自C村,ST10)与EF7(检出自D村,ST206)具有较高的同源性,EF8(检出自I村,ST542)与ES10(检出自B村,ST906)具有较高的同源性,其中EF6、EF7和EF8分离自猪粪便,ES10分离自河流沉积物。3.S1-PFGE和Southernblot结果证实了大部分菌株携带的mcr-1基因为质粒介导,质粒大小范围在33～240kb之间,质粒不相容性分组以IncHI2、IncI2、IncX4等类型为主。质粒介导的mcr-1基因均可通过接合转移到受体菌E.coli J53中,并使受体菌对粘菌素的耐药程度增加甚至超过折点值。4.全基因组测序的结果显示,mcr-1基因的下游均具有一个编码PAP2家族蛋白的开放阅读框,部分菌株的mcr-1上游和/或下游还具有与转座子形成有关的ISAPI1结构。除携带多种抗性基因外,部分菌株还同时携带与肠聚集性大肠杆菌(EAEC)和肠致病性大肠杆菌(EPEC)有关的毒力因子。结论1.携带粘菌素抗性基因mcr-1的产ESBL大肠埃希菌在家庭式养殖地区中广泛检出,且分布在不同的地理位置的不同环境介质中,包括人们直接接触的饮用水和即食蔬菜表面。除人为因素(如畜牧业养殖)外,干旱等自然现象也可能对mcr-1传播的产生影响。2.大部分的携带mcr-1大肠埃希菌除了含有多种抗生素耐药基因外,还可能同时携带对人类发病具有重要影响的毒力因子,突出了这些菌株具有遗传可塑性以及环境介质作为抗生素抗性和潜在致病菌出现的热点所带来的风险。3.家庭养殖地区多环境介质中的携带mcr-1大肠埃希菌具有高度的特异性,mcr-1基因主要由质粒介导;含有mcr-1的质粒在不相容性分组的类型、mcr-1的遗传环境等方面同样具有高度多样性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑机制尚未完全清晰，目前学界普遍接受的观点是在液体环境下，多粘菌素残基上逡逑的氨基发生质子化反应并与细菌外膜上的类脂Ａ磷酸基上的阴离子产生静电吸逡逑引作用，随后质子化的多粘菌素取代二价氧离子（Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋）来稳定脂多糖层，逡逑同时多粘菌素的Ｎ－脂肪酰基链和６、７位疏水部分插入到外膜层，使相邻的脂质逡逑Ａ的磷酸酰基链弱化，导致外膜膨胀然后通过“自促摄取”机制穿过细菌逡逑外膜，从而使细菌膜磷脂双分子层的物理完整性被破坏，细胞内的核苷酸、氨基逡逑酸、磷酸盐等内容物流出，抑制细胞的生长或导致渗透失衡和细菌死亡，具体机逡逑制见图２［３２］。逡逑

通过将磷酸乙醇胺转移至细胞膜脂多糖上的类脂Ａ部分并结合修饰，减少类脂逡逑Ａ淲酸基团的负电荷，使磷酸基团与多黏菌素结合能力变弱，从而导致细菌对粘逡逑菌素不敏感甚至耐药，具体机制见图３［３６］。逡逑——多壚素一￣￣逦产逡逑／逦康多糖逡逑，Ａ逦；邋Ｉ逦一逦硌酸？？．辨胺转移酶－逡逑￥邋二：邋ｍ逡逑＾■＾Ｌｔ逦ｉｉＪｕｙｉａＴＬ邋逦—阁■努逦＾４，逦ＪＬｒｆｇｉｉａｉｎｘＱ逡逑＇逦邋－——岕白—￣逡逑＇邋．，／：：邋￣１＇：；邋＾｜卜逡逑图３．邋ｚｎｃｒ－／导致细菌对粘菌素产生耐药的机制逡逑现有研究表明，ｗｃｒ－７基因通过质粒作为载体存在于自然界微生物中，通过逡逑水平基因转移进行质粒的转移和基因的交换。这种转移模式不同于传统遗传物质逡逑由亲代到子代的转移，传播速度更快［３７］。携带／ｗｒ－７的质粒同时呈现出多样性，逡逑不相容组分型包括ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＩ２、ＩｎｃＸ４、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦ等，质粒大小不一，逡逑分子量范围在３０￣３００ｋｂ之间，其中ＩｎｃＩ２、丨ｎｃＸ４和丨ｎｃＨ１２型最为常见［３８］。质粒逡逑之间的同源性差距较大

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑检测ｍｃｒ－／基因需要用到的ＰＣＲ引物见表３。逡逑表３．／ＷＣＴ－／基因引物逡逑目标基因逦ｉｌｌｉ逦序列（５，－３，）逦产物大小（ｂｐ）￣参考文献逡逑ｍｃｒ－Ｉ－Ｆ邋ＣＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣ逡逑而－丨逦ｍｃｒ－ｌ－Ｒ邋ＣＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＴＧＴＡＧＧＧ逦３０９逦［］逡逑注：Ｆ为上游引物，Ｒ为下游引物逡逑２．邋２具体试验方法逡逑２．邋２．邋１采样点的确定逡逑

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本文编号：2792050