CRISPR系统编辑布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因的初步探索

发布时间：2020-08-14 14:05

【摘要】：CRISPR系统是来源于细菌的一种适应性免疫防御系统,目前,CRISPR已经被雇佣编辑真核生物和原核生物的基因组,并且已发展成为一种高效准确的基因编辑系统。CRISPR系统由CRISPR蛋白和gRNA两部分组成,CRISPR蛋白负责靶向切割目标基因,gRNA通过碱基互补配对特异指导CRISPR蛋白到目标基因。虽然该系统已经在超过16种的细菌中成功编辑了目标基因,但布鲁氏菌等胞内寄生菌仍没有文献报道。由于布鲁氏菌感染引起的布鲁氏菌病在我国,特别是北方地区流行十分严重,目前尚未有良好的防治措施,其感染机制也尚未清晰。如果能成功将CRISPR基因编辑系统引入到布鲁氏菌,将会给布鲁氏菌疫苗开发及相关感染机制研究提供强大的工具。因此,本课题将尝试CRISPR系统编辑布鲁氏菌基因的工作。我们取得了如下相关结果。1、以布鲁氏菌表达载体pBBR2为骨架,成功构建布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3剪切系统(A)。同时,为克服布鲁氏菌缺乏非同源末端修复机制的缺点,将PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-cas9-gRNA1/2/3,构建了另一种PGK的pBBR2-cas9-gRNA1/2/3-H编辑系统(B)。将这两种系统电转入布鲁氏菌S19疫苗株,转化含有A的布鲁氏菌在平板上都不能生长;转化含有B的布鲁氏菌在平板上尽管有少量菌落,但测序检测皆为阴性。而所有对照组(pBBR2-cas9)的转化,布鲁氏菌的生长正常。该实验表明组成型CRISPR/cas9系统能剪切布鲁氏菌基因组,但是不能修复剪切后的缺口。2、由于pBBR2-cas9-gRNA1/2/系统不能编辑布鲁氏菌基因组,我们推测一个可能的原因是细菌来源的cas9脱靶效应,为排除这种可能性。我们利用高忠诚度的组成型CRISPR/Fncpf1和CRISPR/Lbcpf1蛋白,成功构建了pBBR2-Fn/LbCpf1-crRNA剪切系统(C,D),同时,将PGK基因左右各1000bp的同源臂克隆到pBBR2-Fn/Lb Cpf1-crRNA,构建了Fn/Lbcpf1-crRNA1/2/-H(E,F)。将C,D,E,F系统分别电转入布鲁氏菌S19疫苗株,所有转化的布鲁氏菌在平板上都不能生长,但是,对照组(pBBR2-Fn/LbCpf1)的转化,布鲁氏菌的生长正常。该实验表明脱靶效应应该不是CRISPR不能编辑布鲁氏菌基因组的原因。3、由于组成型CRISPR/cas9、CRISPR/FnCpf1和CRISPR/LbCpf1都不能编辑布鲁氏菌基因组,我们推测另一个可能的原因来源于CRISPR的cas9或Fn/LbCpf1表达过于持续,同源重组时间不充分。为此,我们成功构建了布鲁氏菌IPTG诱导型CRISPR/cas9(pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3(G)及含有PGK同源臂的pBBR2-lac-cas9-gRNA1/2/3-H(H))和温度诱导型CRISPR/cas9系统(pBBR2-cits-cas9-gRNA2(J),及含有PGK同源臂的pBBR2-cits-cas9-gRNA2-H(K))。将G,H,J,K系统分别电转入布鲁氏菌S19疫苗株,然后进行相关的诱导,所有转化的布鲁氏菌在平板上都不能生长,但是,相应的未诱导的对照组的转化,依然没有布鲁氏菌生长。该实验表明IPTG诱导系统,以及温敏诱导系统在布鲁氏菌中存在泄漏,不能延迟cas9、Lcpf1和Fncpf1剪切的时间,为同源修复提供更长的时间,从另一个角度说明在含有gRNA的CRISPR系统中cas9或其相关蛋白的表达即使微量对布鲁氏菌也存在毒性,不能用于编辑布鲁氏菌基因组。综上所述,为了探究CRISPR系统能否成为高效的布鲁氏菌基因编辑工具,进行了以上探索研究,成功的构建了5种能切割布鲁氏菌基因组的CRISPR系统,研究表明传统的all-in-one CRISPR还不能成功编辑布鲁氏菌基因,如何在布鲁氏菌中发挥CRISPR的基因编辑功能,具体的机理机制还有待进一步的研究。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

载体,图谱,辣根,布鲁氏菌

育二抗：用 1×TBST 配制的 5%脱脂奶粉的稀释辣根过氧膜放入含相应的二抗稀释液的封口袋中，避免气泡，平放洗涤同上CL 化学发光显色：加入适量 DAB 染色工作液，曝光拍照型 cas9 表达载体 pBBR2-cas9-gRNA-H 的构建阅大量的文献，本课题组找到来源于 pBBRMCS 广宿主质动子，可以在布鲁氏菌中发挥作用。同时，又找到 trc 启以起始 mRNA 的转录。因此我们以 pBBRMCS-2 为载体的方法把 trc 启动子，fd 终止子，gRNA 骨架，T7 终-2 构建 pBBR2-cas9-gRNA-H 载体（图 1.1）。

Marker；1：pBBR2-cas9BR2-cas9-gRNA 质粒ntification of pBBR2-c1/2/3 载体的构建性带来的影响，我们选0bp 的核心序列插入到A1/2/3。连接、转化的构建（图 1.3），与目

质粒,随机性,测序,目的

DNA Marker；1：pBBR2-cas9-gRNA2 pBBR2-cas9-gRNA 质粒的 PCR identification of pBBR2-cas9-gRRNA1/2/3 载体的构建随机性带来的影响，我们选择了，把 20bp 的核心序列插入到测序正-gRNA1/2/3。连接、转化和提载体的构建（图 1.3），与目的大

【参考文献】