Mhp597核酸酶促进猪肺炎支原体感染的分子机制

发布时间：2020-08-14 15:52

【摘要】：猪肺炎支原体引起猪喘气病,并经常与其它病原混合感染。猪肺炎支原体感染后,会破坏气管上皮细胞和肺泡上皮细胞,引起炎症反应和组织坏死。支原体没有合成核酸基础物质的能力,主要通过分泌核酸酶来降解外源性核酸物质来为其生长和代谢提供核酸。另外,支原体核酸酶还能够降解中性粒细胞细胞外陷阱(NETs),促进细胞调亡。因此,核酸酶在猪肺炎支原体感染过程中发挥着重要作用。猪肺炎支原体具有三种核酸酶,即Mhp109、Mhp379和Mhp597。我们通过TGA定点突变后,成功地原核表达并纯化了这三种核酸酶。1μg rMhp597蛋白在15 s内即可将1μg核酸底物彻底降解,说明rMhp597对双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、质粒DNA和RNA这几种核酸物质具有极强的降解作用。并经试验发现,rMhp597酶活性温度范围是17℃-57℃,且具有Ca2+和Mg2+依赖性,C端315-377强碱性极性区是rMhp597的酶活性区。rMhp109和rMhp379的核酸降解活性较弱,活性温度范围为17℃-47℃。中性粒细胞通过分泌以DNA物质为骨架的NETs来捕获致病微生物,致病微生物也能够通过分泌核酸酶降解NETs来逃避中性粒细胞捕获。我们研究发现,rMhp597、rMhpl09和rMhp379均可有效降解NETs,其中rMhp597的作用最强。猪肺炎支原体培养上清也可有效降解NETs,且能被rMhp597多克隆抗体阻断,证实猪肺炎支原体分泌在上清中的Mhp597的核酸降解活性。采用实时荧光定量PCR检测发现,三种重组核酸酶分别降解NETs后,猪肺炎支原体含量均显著高于NETs未降解对照组,说明这三种重组核酸酶通过降解NETs可促进猪肺炎支原体逃避中性粒细胞的诱捕。通过间接免疫荧光发现rMhp109、rMhp379和rMhp597可粘附在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的细胞膜上,也可对PK15细胞引起剂灄相关性的细胞凋亡,降低PK15细胞的活力。通过siRNA干扰或 TAK-242、ST2825、Bay11-7082 抑制 TLR4、MyD88 及 NF-κB 发现,rMhp597 可通过 TLR4、MyD88、NF-κB信号通路上调PAMs IL-]β、IL-8和TNF-α的表达。进一步研究发现,rMhp597的N端跨膜区和C端强碱性极性区的缺失不会影响rMhp597黏附PAMs、产生细胞毒性以及上调促炎细胞因子的活性。另外,rMhp597还可下调PAMsIFN-α/β的表达,并促进PAMs内PRRSV的复制,但rMhp109、rMhp379没有这种作用,三种重组核酸酶也均不能促进PAMs内PCV-2的复制。通过实时荧光定量PCR检测发现,在rMhp597下调PAMs IFN-α/β的过程中,TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和IRF3被显著抑制,由此推测rMhp597可能通过抑制TLR3/TLR7/TLR8/TLR9-IRF3信号通路抑制IFN-α/β的表达。通过截短蛋白研究发现,rMhp597δTM和rMhp597δ315.377均可下调IFN-α/β的表达及促进PAMs内PRRSV的复制,说明N端跨膜区和C端强碱性极性区的缺失不会影响rMhp597蛋白的免疫抑制活性。综上所述,rMhp597、rMhp109、rMhp379均具有核酸酶活性、细胞黏附性和细胞毒性,能够破坏NETs以帮助猪肺炎支原体逃避中性粒细胞捕获。rMhp597的核酸降解作用极强,可显著上调促炎细胞因子、下调IFN-α/β的表达、促进PAMs内PRRSV的复制,是猪肺炎支原体的一种重要毒力蛋白。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
【图文】：

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本文编号：2793233