miRNA-203在绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定

发布时间：2020-08-14 22:36

【摘要】：辽宁绒山羊在绒毛品质和产绒量方面,居世界同类品种前列,所产羊绒属于稀有的特种动物纤维,是一种珍贵的纺织原料。近日国家统计局发布的国内羊绒及山羊数据显示,国内原绒产量自2014年开始逐年下降,且跌幅较大,自产的羊绒原料远远满足不了本土企业和外商投资企业的生产和出口需要。而毛囊作为被毛生长发育的重要部位,无论在胚胎期还是出生后,均具有自我更新和周期性生长的特点,且整个过程多基因参与。因此,通过对调控毛囊发育周期机理的研究来改善和提高羊绒的品质和产量成为近年来的研究目标。miRNAs是在真核生物中发现的内源性的单链非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的非编码区的结合抑制其翻译或引起降解,从而参与生物体的生物学过程。近年来研究团队对绒山羊和细毛羊毛囊周期发育中的miRNA开展了系统的研究,通过高通量测序手段,发现作为上皮组织特异性表达的miRNA-203,参与绒山羊和细毛羊毛囊的发育,但其如何在毛囊周期发育中起调控作用的未见相关报道。因此,miRNA-203被选为本实验的研究目标。利用miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等在线生物学软件预测miRNA-203的靶基因,并筛选出与毛囊发育相关的靶基因,在mRNA水平、蛋白水平和细胞水平上,验证miRNA-203和候选靶基因在绒山羊毛囊周期发育中的表达差异,明确miRNA-203与靶基因的结合位点,阐明miRNA-203对绒山羊毛囊发育周期的调控机理,完善miRNA在毛囊发育周期中的作用,为,提高和改善绒山羊羊绒产量和毛品质提供了新的思路。具体研究结果如下:1.利用在线生物信息学软件miRBase、microRNA.org、TargetScanHuman7.1和microRNA target prediction等预测miRNA-203的靶基因,并筛选出与毛囊发育相关的靶基因:DDOST、NAE1和GLYATL2。2.同源性分析,对DDOST、NAE1和GLYATL2测序表明与绵羊、牛等物种的同源性高达95%以上,说明靶基因序列具有遗传保守性。3.在mRNA水平上,对miRNA-203及DDOST、NAE1和GLYATL2进行鉴定发现,miRNA-203在绒山羊毛囊发育的生长期和休止期均有表达,且在休止期的表达量显著高于生长期;候选靶基因的表达则相反。-4.对靶基因DDOST和NAE1进行蛋白鉴定,结果表明,DDOST和NAE1在绒山羊生长期中表达上调,结果与荧光定量结果一致。体内实验的结果初步表明miRNA-203通过DDOST和NAE1参与绒山羊毛囊周期发育。5.双荧光素酶报告基因系统鉴定miRNA-203与靶基因DDOST和NAE1的特异性结合位点表明,在DDOST和NAE1的3’UTR上存在miRNA-203的靶位点—GAACCAC、GGCGTCC。6.通过体外实验,对细胞进行转染,在mRNA水平和蛋白水平上,对过表达miRNA-203后的miRNA-203及DDOST和NAE1进行验证,结果表明,miRNA-203在mimics组的表达量明显高于阴性对照组,而靶基因的表达则相反,miRNA-203显著下调DDOST和NAE1的表达。综上,miRNA-203通过负调控靶基因(DDOST和NAE1)参与毛囊周期发育,可作为一种进一步选育优质羊品种的方法手段。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827.2
【图文】：

要的附属可再生器官，是毛纤维的 发源地质细胞各成分相互作用的复杂的生物学过程[1、皮脂腺（SG）、隆突部（Bu）和毛球（HB）质、毛皮质和毛小皮组成[4]，内根鞘（IRS）和的形成是毛囊形态发生最重要的一步，这也外根鞘位于内根鞘的外层，被结缔组织鞘包裹号通路直接或间接影响毛干的生长发育[5]，毛干是上皮细胞和毛母质细胞受真皮乳头传毛根和毛干的形成提供营养物质，毛球包围lla cells, DPCs)是位于毛囊基底部的真皮源性主导作用，被视为毛囊发育调控中枢[9]。引乳头细胞结构或功能异常，已成为研究毛囊

浓度(ng/μl) OD260/230OD260/280休止期 浓度(ng/μl) OD260/230O452.76 1.847 2.015 1 513.16 1.577 2.583.00 1.584 1.963 2 475.88 1.578 2.717.09 1.772 1.979 3 511.92 1.592 1.401.24 1.849 2.003 4 410.64 1.628 1.517.00 1.576 1.986 5 350.44 1.713 1.538.68 1.645 2.008 6 556.92 1.517 2.定量 PCR 检测 miRNA-203 在生长期和休止期绒山羊皮肤组织中验利用荧光定量PCR试剂盒检测miRNA-203在绒山羊生长期和休平。并对数据进行统计学分析。结果表明：miRNA-203 在绒山羊期的皮肤组织中均有表达，且在休止期的表达量高于生长期，差异.1，**P<0.01）。

miRNA-203NXPH4、B3GNT5、CNTNAP2、NOX4、LRTOMT、Wnt4、SLC7a6os、AKTN1、NAE1、JPH3、CCDC7、ITGA2、HSPB8、FOXP1 、 ATG12 、 DDOST 、 BAT2 、CD8B、GLYATL2、ILRB2、MANBAL、P2RX73.2 靶基因序列分析3.2.1 靶基因测序结果靶基因 PCR 的产物送库美生物公司进行测序。测序结果如图 2.1 所示：去除前几个不稳定的碱基外，峰值表现单一，送检样品纯度较高。同时结果也显示，GLYATL2、DDOST 和 NAE1 片段大小分别为 204 bp、270 bp、176 bp，与设计的片段大小基本一致，表明测序正确。

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本文编号：2793628