牦牛卵巢Label-free蛋白组学分析及相关蛋白在生殖系统的表达

发布时间：2020-08-15 11:08

【摘要】：牦牛是藏区牧民重要的家畜,但其繁殖能力低,通常两年一胎或三年两胎,在其整个生命周期中高产者仅能产仔四到五头。在牧草较为丰盛的条件下牦牛的发情期也较短,牦牛发情只有一到二天,这样低的繁殖力远远满足不了牧民的需求,同时也制约着牦牛种群的扩大。而且受自然条件和技术手段限制,其调控繁殖相关分子研究较少且不全面。因此,寻找牦牛繁殖调控相关分子标志物,解决其低繁殖力是亟待解决的重要问题。为了更深入研究牦牛生殖生理分子调控机制,进一步提高其繁殖力,本研究使用Label-free蛋白质组学定量方法筛选牦牛黄体期和卵泡期卵巢的差异表达蛋白,并运用生物信息学分析这些差异表达蛋白质的功能及参与生物学过程或代谢途径。同时运用QRT-PCR、Western blot及免疫组化技术,对采集的卵巢、子宫、输卵管中差异表达蛋白进行定量、定性和定位研究,以期找出可能影响牦牛生殖的差异蛋白及其定位表达,实验结果如下:(1)采用Label-free蛋白质组学技术分析牦牛黄体期和卵泡期卵巢组织蛋白的变化,筛选两个时期的差异表达蛋白,结果显示:在黄体期鉴定到2867个蛋白,卵泡期鉴定到2180个蛋白,有2011个蛋白在这两个时期中均表达,856个蛋白只在黄体期表达,169个蛋白只在卵泡期表达。差异表达蛋白63个(P0.05),其中黄体期较卵泡期有47个蛋白表达上调,16个蛋白表达下调。(2)对筛选出的差异表达蛋白进行生物信息学分析,Go分析结果表明差异表达蛋白主要分布在细胞膜和胞外区部分,主要功能体现在粘连活性方面;对所鉴定出的卵巢差异表达蛋白进行了COG分析,结果发现参与翻译、核糖体结构和生物发生、RNA加工和修饰、转录、生物信号通路转导、翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣、代谢等蛋白质均出现,其中出现频数最高的蛋白质为发挥生物信号通路转导机制的蛋白质类,而出现频数最低的蛋白质则为参与细胞运动的蛋白质;通过KEGG分析这些差异蛋白主要参与类固醇生物合成、趋化因子信号通路、蛋白质在内质网中的加工、甘油磷脂代谢、碳代谢、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、NOD样受体信号通路、嘌呤代谢途径、RNA运输途径、胰脏分泌代谢途径、RNA降解代谢途径、HIF-1信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号通路、钙离子信号通路、谷胱甘肽代谢等途径。(3)QRT-PCR与Western blot验证了FSHR、LHR、St AR、Rab-8a、HSP105在牦牛黄体期与卵泡期的卵巢、子宫及输卵管组织中的表达。结果表明:FSHR、St AR、HSP105在卵泡期表达量明显高于黄体期,而LHR和Rab-8a则在黄体期呈现上调。FSHR在黄体期卵巢、子宫、输卵管中呈现出明显的下调作用;LHR在黄体期卵巢、子宫、输卵管中均呈现上调;黄体期与卵泡期相比,St AR在卵泡期卵巢组织中的表达是黄体期的5.05倍,在子宫中的表达是黄体期2.38倍,差异极显著(P0.01),在输卵管中的表达是黄体期的1.82倍,差异显著(P0.05);Rab-8a在卵巢、子宫、输卵管中的表达卵泡期均低于黄体期,差异显著(P0.05);HSP105在卵巢、子宫、输卵管中的表达黄体期均低于卵泡期(P0.05)。(4)免疫组化结果显示:在黄体期,FSHR主要在卵巢颗粒细胞层、子宫固有膜的结缔组织以及输卵管的黏膜上皮细胞呈阳性表达;LHR主要在卵巢卵泡颗粒细胞层、子宫的黏膜上皮细胞及输卵管的黏膜上皮细胞呈阳性表达;St AR主要在卵巢闭锁卵泡的颗粒细胞层和输卵管的黏膜上皮有弱阳性表达,但在子宫中未见表达;Rab-8a主要在卵巢闭锁卵泡颗粒层细胞、子宫和输卵管的黏膜上皮有弱阳性表达;HSP105主要在卵巢的结缔组织和髓质区动脉血管的肌层、子宫和输卵管的黏膜上皮有阳性表达。在卵泡期,FSHR主要在卵巢的卵泡颗粒细胞层、子宫的黏膜上皮以及黏膜固有层的结缔组织和子宫腺上皮细胞,以及输卵管的黏膜上皮细胞均有阳性表达;LHR主要在卵巢的生殖上皮和初级卵泡、子宫的黏膜上皮细胞以及固有层的结缔组织和子宫腺上皮细胞,以及输卵管的黏膜上皮中均呈阳性表达;St AR主要是在卵巢的卵泡颗粒细胞层、子宫黏膜固有层的子宫腺上皮和结缔组织以及输卵管的黏膜上皮内均有阳性表达;Rab-8a主要是在卵巢的卵泡颗粒细胞层、子宫黏膜固有层的结缔组织及输卵管的黏膜层上皮内有弱阳性表达;HSP105主要是在卵巢的卵泡颗粒细胞层、子宫黏膜固有层的子宫腺上皮和输卵管的黏膜上皮中均有阳性表达。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823.85
【图文】：

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图 1 细胞培养氨基酸稳定同位素标记原理Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture谱多反应监测技术（MRM）作为一种目标蛋白组定量技术，其主要依为三重四级杆质谱[28]。首先使用液相分离蛋白质，通过雾化器对电离蛋赋予电荷，再使用碰撞诱导分离母离子，最终使用三重四极质谱仪对单子进行扫描（图 2）。MRM 被用于鉴定野生型和突变型蛋白质的差别于其高精准度故而可以用来精准定量，也可以用来回答关于单个细胞中绝对拷贝数的基本问题，其中在哺乳动物细胞和人体的数字建模以及肿异常蛋白的相对水平中是必不可少的，并且对于诊断有很重要的作用也被用作触发肽的完整产物离子扫描的方法，可以检测低于检测极限的后修饰[29, 30]的标准质谱分析[31]。2017 年，MRM 已发展成为一种高度重复的基于质谱的蛋白质靶向检测平台，并且已经证明基于 MRM 的在白质组学应用方面优于传统的基于抗体的蛋白质生物标志物诊断

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Figure 1 Principle of stable isotope labeling of amino acid in cell culture质谱多反应监测技术（MRM）作为一种目标蛋白组定量技术，其主要依靠的仪器为三重四级杆质谱[28]。首先使用液相分离蛋白质，通过雾化器对电离蛋白质样品赋予电荷，再使用碰撞诱导分离母离子，最终使用三重四极质谱仪对单一的母离子进行扫描（图 2）。MRM 被用于鉴定野生型和突变型蛋白质的差别，同时由于其高精准度故而可以用来精准定量，也可以用来回答关于单个细胞中蛋白质的绝对拷贝数的基本问题，其中在哺乳动物细胞和人体的数字建模以及肿瘤中遗传异常蛋白的相对水平中是必不可少的，并且对于诊断有很重要的作用。MRM 也被用作触发肽的完整产物离子扫描的方法，可以检测低于检测极限的特定翻译后修饰[29, 30]的标准质谱分析[31]。2017 年，MRM 已发展成为一种高度灵敏且可重复的基于质谱的蛋白质靶向检测平台，并且已经证明基于 MRM 的在临床蛋白质组学应用方面优于传统的基于抗体的蛋白质生物标志物诊断如ELISA[32]。

三维图,三维图,卵泡刺激素

而选择更合适的胚泡转移时期。胚胎的蛋白质组学研究也在低级物种，例如斑马鱼中进行。这种模式生物体研究破译脊椎动物发育中的调节网络时是有用的，但对于高等生物是不可能。因此，从它们获得的结果来推断哺乳动物的生殖应谨慎对待[71]。卵泡刺激素和黄体生成素的生理学意义卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）是由垂体前叶嗜碱性细胞泌和合成的一种由 α 和 β 两个亚基组成的异质二聚体组成的糖蛋白激素，β 亚与 α 亚基集合才能发挥 FSH 的生物学活性见图 3[95, 96]。FSHβ 亚基氮端长度不致，故而 FSH 具有种属差异。FSH 临床上用于雌性动物，调控其发情周期使发情，或是在排卵期前促进卵泡和卵子的发育，从而促进排卵以达到体内受精目的。Roker 和 Richards 等人证明 FSH 对于生育发育有重要的意义，主要功能引起卵泡的发育[13]，一定量的 FSH 可以抑制早期卵泡的闭锁[14]。

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