表达IL-7的重组犬瘟热病毒的构建与鉴定

发布时间：2020-08-15 11:34

【摘要】：犬瘟热是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的感染犬和浣熊等食肉动物并呈世界范围分布的一种传染病。犬瘟热具有高度的传染性,严重影响养犬业和毛皮动物养殖业的发展。CDV弱毒活疫苗的广泛使用大大降低了犬瘟热的爆发,但仍有报道在已免疫过的犬中出现CDV的感染。传统的CDV弱毒活疫苗的免疫效果易受母源抗体的干扰,此外不同易感动物对这些疫苗的敏感性也有差异,可能导致接种动物产生脑炎等不良反应。因此,开发一种安全、高效的CDV疫苗对控制犬瘟热的流行至关重要。CDV作为一种不分节段的单股负链RNA病毒,可包装容纳和稳定表达较大片段的外源蛋白的基因,在自然状况下很少或不发生基因交换现象,上述生物学特性提示CDV可作为一个很好的疫苗载体。因此,本研究以实验室保存的CDV弱毒疫苗株CDV11为亲本毒株,构建了CDV11全长cDNA感染性克隆pAC-CDV11,并成功拯救出重组犬瘟热病毒rCDV11,建立了该毒株的反向遗传操作平台。rCDV11在Vero细胞上的感染能力和生长特性与母本病毒株CDV11无显著差异。为了找到合适的CDV11载体外源基因插入位点,我们将绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因插入CDV11基因组不同基因之间的非编码区,拯救出各重组犬瘟热病毒,评估不同位置表达外源蛋白的能力。结果发现,将GFP基因插入CDV11基因组P-M基因之间非编码区的重组犬瘟热病毒rCDV-P/GFP/M在Vero细胞上的生长特性与亲本株rCDV11相似,能稳定、高效的表达GFP,具有良好的遗传稳定性。结果表明CDV弱毒疫苗株CDV11具有作为活疫苗载体表达外源蛋白的潜力,P-M基因之间非编码区可作为一个较好的外源基因插入位点。白介素-7(Interleukin-7,IL-7)作为一种细胞因子,参与调控淋巴细胞生长发育,在多种病毒诱导的免疫反应过程中发挥着重要作用。接下来,我们构建了表达鼠源IL-7的重组犬瘟热病毒rCDV-IL7,rCDV-IL7在Vero细胞中的生长特性与亲本株rCDV11无显著差异,表明IL-7的表达不影响重组犬瘟热病毒的复制和扩散。将rCDV-IL7在Vero细胞上连续传10代,各代次病毒滴度均介于10~(6.0)-10~6.5.5 TCID_(50)/mL之间,且能稳定表达IL-7,表明重组犬瘟热病毒rCDV-IL7在Vero细胞中具有良好的遗传稳定性。酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测结果表明重组犬瘟热病毒rCDV-IL7可在Vero细胞中表达IL-7且具有剂量依赖性。细胞活性检测结果表明IL-7的表达对Vero细胞无明显毒副作用。为研究重组犬瘟热病毒对小鼠的致病性,分别将重组病毒rCDV-IL7和rCDV11经脑部途径和肌肉途径感染小鼠,所有感染重组犬瘟热病毒的小鼠均未出现犬瘟热临床症状,与对照组相比,小鼠体重变化均无显著性差异。结果表明IL-7的表达没有增加rCDV11对小鼠的致病性。为进一步研究rCDV-IL7的免疫原性,将重组病毒rCDV-IL7和rCDV11分别按1×10~5 TCID_(50)/100μL/只的剂量,肌肉途径免疫小鼠,在初次免疫3 w后以相同途径、相同剂量再次免疫小鼠。初次免疫后连续10 w检测小鼠体内CDV中和抗体水平。结果发现两组小鼠在加强免疫后,免疫反应迅速增强,与rCDV11相比,rCDV-IL7可诱导小鼠产生更高滴度的中和抗体。综上所述,我们成功建立了CDV弱毒疫苗株CDV11的反向遗传学系统,并构建了表达IL-7的重组犬瘟热病毒rCDV-IL7。重组犬瘟热病毒rCDV-IL7具有良好的生物安全性和免疫原性,可刺激小鼠产生高水平的CDV中和抗体,有望成为一株安全高效的犬瘟热病毒疫苗株。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

示意图,基因组结构,示意图,南美

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文核苷酸组成，5’端前导（尾随）序列大约由 38 个核苷酸组成(Haig 19a et al 2006)。V 只有一种血清型，依据 H 蛋白的多样性，可分为几种基因型，分别型、美国 II 型、亚洲 I 型、亚洲 II 型、欧洲野生型、欧洲和南美 I 型、、南美 III 型等(Ke et al 2015；Panzera et al 2015)。H 基因序列分析发生了与 CDV 地理区域相关的遗传漂变。机体可以针对 H 蛋白产生适当应来清除 CDV 的感染，这使得 H 蛋白可作为一个合适的靶标来研究基与分子流行病学(Budaszewski Rda et al 2014；Hashimoto et al 2001)。

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00 marker;A:3192bp; B:3185bp; C:3150bp; D:3131bp; 图 3-2 CDV11 全长分段 PCR 结果Fig.3-2 PCR result of five fragments图 3-3 pAC-CDV11 的构建示意图

示意图,示意图,聚合酶,细胞

30图 3-3 pAC-CDV11 的构建示意图Fig.3-3 Schematic diagram for the construction of pAC-CDV11.2 病毒的拯救由于 BHK-21 细胞不表达 T7 RNA 聚合酶，额外转染了表达 T7 RNA 聚合酶粒 pCAGGS-T7。采用磷酸钙转染的方法，将 pCAGGS-T7、pAC-CDV11、NA3.1(+)-CDVN、pcDNA3.1(+)-CDVP和pcDNA3.1(+)-CDVL共转染BHK-2。转染 2-3d 后，取 300μL 细胞上清接种于 6 孔板中细胞汇合度约为 70%-80% Vero-DST 细胞中。待 Vero-DST 细胞出现病变时，收获病毒液，作为获救的 P0 代。提取出现病变细胞的 RNA，通过 RT-PCR 对获救病毒 rCDV11 进

【参考文献】