内蒙古绒山羊精液冷冻保存方法优化及精液稀释液主要成份的作用机制研究

发布时间：2020-08-17 15:44

【摘要】：精子结构、生化和生理功能在冷冻解冻过程中会受到严重的破坏,如何将精液在冷冻解冻过程所受的损伤降到最低一直是人们研究的热点。为了进一步提高绒山羊精液冷冻保存后的质量,本研究以Tris稀释液为基础,比较了液氮熏蒸高度、精清、卵黄和大豆卵磷脂对内蒙古绒山羊精液的冷冻保存效果的影响,筛选出适合绒山羊精液冷冻保存的方法;在此基础上研究了氧化磷酸化和糖酵解对绒山羊精液冷冻保存和解冻后的作用;并进一步分析了葡萄糖、海藻糖和胆固醇在绒山羊精液冷冻保存过程中作用机制。精液冷冻解冻后分别检测了精子运动性能、精子结构完整性、精子中活性氧(ROS)、Ca2+、ATP;精子悬浮液中的丙酮酸和乳酸水平;检测了精子凋亡率和线粒体膜电位;分析了精子中AMPK、phospho-AMPK以及蛋白质酪氨酸磷酸化。结果如下:1、精液经稀释后冷却至5℃,在距离液氮液面H1(4cm)和H2(9cm)处熏蒸7min后冷冻保存,结果表明,冷冻解冻后,与H1(4cm)相比,H2(9cm)组的精子活率极显著降低(P0.01),顶体完整性和质膜完整性极显著降低(P0.01),DNA完整性无显著差异。因此,在距离液氮液面4cm处熏蒸7min后冷冻保存效果较好。在精液冷冻保存过程中,去除精清,结果显示冷冻解冻后精子活率和速率极显著降低(P0.01),精子顶体完整性和质膜完整性显著降低(P0.05),DNA完整性极显著降低(P0.01),以及脂质过氧化水平极显著升高(P0.01),因此,精清的存在更有利于精子的冷冻保存。在绒山羊精液冷冻保存过程中,在冷冻稀释液中添加1.5%大豆卵磷脂与10%卵黄相比,精子运动性能、结构完整性和脂质过氧化水平无显著性差异,因此大豆卵磷脂可以代替卵黄保护精子免受冷冻损伤。2、在绒山羊精液冷冻保存过程中,抑制氧化磷酸化和糖酵解作用后,冷冻解冻后,精子运动性能和结构完整性显著下降(P0.05),线粒体膜电位显著降低(P0.05),脂质过氧化水平极显著升高(P0.01)。解冻后,抑制氧化磷酸化作用后,精子几乎失去运动能力,线粒体膜电位显著下降(P0.05);抑制糖酵解作用后,精子运动性能显著下降(P0.05),然而线粒体膜电位无显著性差异。因此,在绒山羊精液冷冻保存过程中,糖酵解和氧化磷酸化对维持精子的质量和代谢具有同等重要的作用。解冻后氧化磷酸化和糖酵解对维持精子的运动性能均具有重要的作用;在维持线粒体活性方面,氧化磷酸化的作用更明显。3、在冷冻稀释液中添加不同浓度(0-112mmol)的葡萄糖,结果发现56 mmol葡萄糖可以明显提高精子冷冻解冻后活率、运动速率、顶体和质膜完整性(P0.05)。56 mmol葡萄糖组中的精子细胞中ROS水平显著升高(P0.01);28 mmol和56 mmol葡萄糖组中的精子细胞中Ca2+水平显著低于其它各组(P0.01);与其它各组相比,56 mmol和84 mmol葡萄糖组中的精子细胞中ATP浓度较高(P0.05)。精液解冻后,在低葡萄糖浓度组(28-56 mmol)的精子悬浮液中未检测到乳酸,而112 mmol组中检测到大量乳酸(P0.01)。因此,冷冻稀释液中添加适量葡萄糖可以促进精子的代谢,但高浓度葡萄糖可能因为乳酸的大量产生抑制精子冷冻保存后的运动能力。4、精液稀释于含有海藻糖和和葡萄糖的稀释液中,对精子的活率、质膜完整性和顶体完整性无显著性影响,但DNA完整性和线粒体膜电位显著升高(P0.05),精子中ROS和Ca2+水平显著降低(P0.01),以及显著降低脂质过氧化水平(P0.05);在GT-100组(100mmol海藻糖和56mmol葡萄糖),解冻后,在顶体前端、赤道段和精子尾部中段发现存在大量的phospho-AMPK。因此,海藻糖可能通过激活AMPK发挥抗氧化作用。5、精液经过不同浓度胆固醇环糊精(CLC)处理后,没有引起精子活率的差异(P0.05),但顶体和质膜完整性显著升高(P0.05),DNA完整性极显著升高(P0.01);精液经过1 mg/ml和2 mg/ml的CLC处理后,解冻后的精子线粒体膜电位显著升高(P0.05),精子中ROS水平显著下降,Ca2+水平显著下降(P0.05);2 mg/ml的CLC处理降低了冷冻解冻后精子中70 KDa蛋白酪氨酸磷酸化,并延迟了A23187对精子诱导的顶体反应。总之,将绒山羊精液稀释于含有56 mmol葡萄糖的Tris稀释液中,冷却至5℃的精液在距离液氮液面4 cm处熏蒸7 min后冷冻,最适合内蒙古绒山羊精液冷冻保存。葡萄糖、海藻糖和胆固醇通过不同的作用途径影响了绒山羊精液的冷冻保存。通过以上研究,为绒山羊精液冷冻保存提供理论依据。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
【图文】：

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的冷冻速率都可能导致细胞受到冷冻损伤，合适的形成冰晶而损伤细胞，另外，不同类型的细胞都存速率。保存过程中，除了冷冻过程会对精子造成机械损伤，对精子造成损伤。在解冻过程中通过水浴温度和。在山羊精液冷冻保存的早期研究中，将冻精细管解冻 12-30s，或者，将冻精细管置于 5℃的水浴中的方法优于缓慢解冻方法[53]。事实上，低解冻速率而且由于进入细胞的渗透性保护剂不会快速地离开，使水渗入细胞，最终破坏质膜结构。因此，最佳解冻过程中细胞内外渗透压的平衡。也有研究发现度提高到 70℃，7s，与 37℃ 2 min 或 40℃ 20s 相质膜完整性显著提高[54]，然而要严格控制时间，因度特别敏感。

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图 2 流式细胞仪检测解冻后精子质膜完Fig.2 Flow cytometry detect the post-thaw sperm acrosomembrane and DNA integr注：（ A）精子细胞群，（ B）精子自发光密度图， C.PI/A质膜损伤精子细胞；Q2-2：质膜损坏的晚凋亡精子细胞； Q质膜完整的早凋亡精子细胞。 D.Acridine Orange 荧光染色整的精子细胞群，靠近横轴是 DNA 断链或解旋的精子细胞荧光为 DNA 完整，橘色荧光是 DNA 断链或解旋。Note ： A. Sperm population; B. Sperm auto- fluorescent fluorescent density map. Q2-1. sperm with a damaged plasma with a damaged plasma membrane; Q2-3. live sperm with a apoptotic sperm with a intact plasma membrane. D. Acridine panel shows sperm with a intact DNA close to the vertical axhorizontal axis. The left panel is observed under a fluorescenintact DNA, orange fluorescence is DNA damaged.

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内蒙古绒山羊精液冷冻保存方法优化及精液稀释液主要成份的作用机制研究子（如图 3A）马斯亮蓝染色法：将一支冻精细管解冻后，加入适量 PBS 洗涤心 3 min，小心除去上清。加入 1 mL 3.7%的多聚甲醛，悬 20 mi n，离心去上清（同上）。PBS 洗涤两次后悬浮，取适涂片，空气干燥。之后利用 0.22%的考马斯亮蓝染液染色 5 mO 洗去多余染液，空气干燥后，中性树胶封片，进行显微镜计五个不同的视野，200 个精子以上。考马斯亮蓝染色后，不同的类型，Ⅰ型：顶体完整，外形正常，着色均匀，顶体型：顶体轻微膨胀，质膜疏松膨大；Ⅲ型：顶体破坏（或者精子质膜严重膨胀受损，着色浅，边缘不整齐；Ⅳ型：顶体坏。统计Ⅰ和Ⅱ为完整顶体精子。

【参考文献】