融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭IL-2基因重组腺病毒的构建及其免疫保护研究

发布时间：2020-08-18 12:25

【摘要】：自2010年4月鸭坦布苏病毒病在中国首次被发现以来,该病迅速在中国沿海地区广泛传播,给养殖产业造成了巨大的经济损失。本研究通过构建融合性鸭坦布苏病毒E基因和鸭白介素2基因的重组腺病毒质粒,为鸭坦布苏病毒病的重组腺病毒疫苗的开发奠定基础。(1)重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的构建及鉴定。用RT-PCR方法分别将1353bp的鸭坦布苏病毒E基因和鸭350bp的白介素2基因串联构成1733bp的融合片段克隆到腺病毒穿梭载体中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pshuttle-E-IL-2,同时构建病毒E基因质粒pshuttle-E作为对照,分别与骨架载体共转染进HEK293细胞,经PCR和免疫印迹鉴定获得重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E。病毒可在HEK293细胞中连续传代20代以上,具有基因组稳定性。纯化后检测rADV-E-IL-2滴度达到4.0×10~(10)PFU/mL,rADV-E滴度达到6.0×10~(10)PFU/mL。(2)重组腺病毒对雏鸭的免疫保护试验。将80只1日龄雏鸭随机均分为五组(rADV-E-IL-2组、rADV-E组、rADV-N组、WF100组和PBS组),分别用重组腺病毒rADV-E-IL-2、重组腺病毒rADV-E、空载的重组腺病毒rADV-N、商品化鸭坦布苏弱毒疫苗WF100株和PBS于雏鸭7日龄和21日龄进行皮下注射。结果显示,rADV-E-IL-2组和rADV-E组可诱导产生抗鸭坦布苏病毒的特异性IgG,rADV-E-IL-2组抗体水平在首免后35d达到最高峰1.39,和其余组相比差异性显著(P0.05)。rADV-E-IL-2组和rADV-E组均具有中和病毒能力,rADV-E-IL-2组和rADV-E组中和抗体效价在首免后35d达到最高峰,rADV-E-IL-2组为1:55,rADV-E组为1:44。rADV-E-IL-2组和rADV-E组均能显著提高外周淋巴细胞的增殖,增殖指数分别为3.13和2.69,与rADV-N组、PBS组相比差异性显著(P0.05)。rADV-E-IL-2组和rADV-E组血清中细胞因子IL-2含量(94.78pg/mL、76.18pg/mL)、IL-6含量(66.43pg/mL、59.45 pg/mL)和IFN-γ含量(201.51pg/mL、128.61pg/mL)与rADV-N组、PBS组相比差异性显著(P0.05)。在攻毒保护试验中,rADV-E-IL-2组和rADV-E组雏鸭未发生临床症状,剖检脾脏无病变。rADV-E-IL-2组检测脾脏内鸭坦布苏病毒拷贝数为101.22copies/μL,rADV-E为101.81copies/μL,两者与rADV-N组、PBS组相比差异性显著(P0.05)。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

结果.1 目的基因 PCR 扩增以DTMUV CQW1株和鸭外周血淋巴细胞cDNA为模板，用待融合DTMUV E物和待融合鸭IL-2基因引物进行PCR扩增，再将两个片段进行融合扩增出E-I片段，凝胶电泳检测可见一条约1700bp条带（图2-1a），与预期E-IL-2片段大，测序结果正确；以DTMUV CQW1株cDNA为模板，用CQW1 E基因引物进行增，凝胶电泳检测可见一条约1300bp条带（图2-1b），与预期DTMUV E基因符，测序结果正确。

图 2-2 重组穿梭质粒 pshuttle- E-IL-2 和 pshuttle- E 的双酶切鉴定（a）M：DNA Marker；1：pshuttle -E-IL-2 EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切；（b）M：DNA Markpshuttle -E EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切Fig. 2-2 Identification of pshuttle-E-IL-2 and pshuttle-E by restriction endonuclease diges(a)M: DNAMarker; 1: pshuttle-E-IL-2 was digested with EcoRⅠand BamHⅠ(b)M: DNA Marpshuttle-E was digested withEcoRⅠand BamHⅠ3.3 重组腺病毒的包装将重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染进 HEK293 细胞。如图 2-3 所示：后第 2d，荧光显微镜下部分 HEK293 细胞可见到有 GFP 的表达，且转染质粒HEK293 细胞荧光表达量逐天递增，先是呈现星云状然后荧光逐渐向外增加。转第 10d，光学显微镜下可见 HEK293 细胞形态发生变化，如圆缩、聚集成葡萄串明显病变效应，至转染后第 16d，细胞出现大面积固缩、脱落、裂解等明显的病收集 HEK293 细胞反复冻融 3 次后保存于-80℃。同时，空白对照组细胞无病变

16图2-4 重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的PCR鉴定（a）M：DNA Marker；1：rADV-E-IL-2中E-IL-2片段的PCR产物；2：空载腺病毒对照（b）M：DNA Marker；1：rADV-E中DTMUV E基因的PCR产物；2：空载腺病毒对照Fig. 2-4 PCR identification of rADV-E-IL-2 and rADV-E（a）M: DNA Marker ; 1: E-IL-2 fragment amplified from rADV-E-IL-2; 2: rADV-N control.（b）M: DNA Marker ; 1:DTMUV E gene amplified from rADV-E; 2: rADV-N control.3.4.2 重组腺病毒 Western blot 鉴定分别提取重组腺病毒rADV-E-IL-2、rADV-E和空载腺病毒rADV-N感染HEK293细胞的总蛋白，如图2-5：经western blot检测，重组腺病毒rADV-E-IL-2能在HEK293细胞中表达E-IL-2蛋白，观察到约70kD大小特异性条带，与预测蛋白大小相符；重组腺病毒rADV-E能在HEK293细胞中表达DTMUV E蛋白，观察到约60kD大小特异性条带，与预测蛋白大小相符；而感染空载腺病毒rADV-N的细胞则未能检测到蛋白条带。图2-5 重组腺病毒rADV-E-IL-2和rADV-E的western blot鉴定（a）M：蛋白分子质量标准；1：感染rADV-E-IL-2的细胞裂解物；2：感染空载腺病毒rADV-N的细胞裂解物（b）M：蛋白分子质量标准；1：感染重组腺病毒rADV-E的细胞裂解物Fig

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本文编号：2796218